液相色谱-串联质谱法同时测定养殖水体中孔雀石绿和结晶紫含量

丁勇，张秀妍，王骏，马琳

(大连市水产技术推广总站， 辽宁 大连 116023)

孔雀石绿(malachite green，MG)和结晶紫(crystal violet, CV)是人工合成的三苯甲烷类工业染料，MG广泛应用于印染、食品加工、医药行业等各个领域中，CV在细胞学、组织学和细菌学等方面也有广泛的应用[1-2]。在水产养殖和水产品运输过程中，MG和CV曾被用于治疗水生动物疾病和用作水体消毒剂[3]。MG和CV进入水体后，部分被水生动物吸收，代谢还原成脂溶性的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，因其化学官能团三苯甲烷具有致癌、致畸、致突变等毒副作用[4]，在2002年中国农业部 193公告中的《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》规定，禁止在所有动物性食品中使用MG[5]。世界上其他国家也在水产养殖业中禁止使用CV[6]。但是由于MG和CV的抗菌效果好、价格低廉易得，以及部分养殖用户对毒副作用长期累积认识不足等原因，目前在水产养殖业中仍存在违规使用的情况，部分养殖水体中MG和CV检出事件偶有发生[2]，这对养殖的水体环境、水产品的出口贸易和人们的身体健康等都会产生不良影响[7-8]。

目前，检测MG、CV及其代谢物残留量的常用方法有高效液相色谱法、液质联用法等。高效液相色谱法通过保留时间定性、外标法定量，前处理过程繁琐，且与液质联用相比，定性准确性稍差。水体中MG和CV的残留通常很低，因此需要灵敏度高、定性可靠、定量准确的方法[9-11]。有研究人员对养殖水体中MG和CV及其代谢物的检测方法做了研究[12-13]，但鉴于其代谢物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫均为脂溶性化合物，在水中溶解度很小，含量极低[14]，因而需要更多的相关研究。本实验建立了应用液相色谱-串联质谱法同时测定养殖水体中MG和CV含量的方法，有效校正了前处理过程中的误差和损失，并采用内标法提高回收率，方法稳定、可靠，可为检测养殖水体中MG和CV含量提供方法支持。

1 实验方法

1.1 样品采集及准备

实验中用到的水样分别采自辽宁省庄河刘家水产养殖场、金州新丰水产育苗场和顶厨饭店暂养池，采样时，用少量水样清洗500 mL棕色玻璃细口瓶两次，再慢慢将瓶充满，盖紧瓶塞。水样到达实验室后先经0.45 μm滤膜过滤，除去水中的固体杂质，备用。

1.2 仪器设备

本实验使用的主要仪器包括：I-Class超高效液相色谱(美国Waters公司)；TQ-S三重四级杆串联质谱仪(美国Waters公司，配有电喷雾ESI源)；超纯水仪(美国Millipore公司)；分液漏斗振荡器；旋转蒸发仪；涡旋振荡器；固相萃取装置；电子天平等。

1.3 药品与试剂

本实验使用的主要药品包括：孔雀石绿标准品(纯度大于94%，德国Dr. Ehrenstorfer公司);结晶紫标准品(纯度>95%、Sigma公司)；氘代孔雀石绿(MG-D5)、氘代结晶紫(CV-D6)标准品(纯度>95%， VITEG公司)；中性氧化铝小柱(Waters，3 g/6 mL)，使用前用5 mL乙腈活化；乙腈(色谱纯，Fisher)；二氯甲烷(色谱纯，Tedia)；乙酸胺(优级纯，天津科密欧公司)；5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液；甲酸(优级纯，Thermo试剂)等。

1.4 配制标准溶液

准确称取MG、CV、氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各10.0 mg，用乙腈分别配制成100 μg/mL标准储备溶液，-18 ℃避光保存。用乙腈逐级稀释成MG和CV的混合标准使用液、氘代孔雀石绿和氘代结晶紫的混合标准使用液，终浓度均为100 ng/mL。用乙腈-乙酸铵溶液(1∶1,V/V)稀释前述混合标准使用液配制成适当浓度的混合标准上机溶液，每毫升该混合标准上机溶液中含有氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各2.0 ng[15]。

1.5 样品前处理

移取水样 100.0 mL，置于 250 mL 分液漏斗中。向分液漏斗中加入质量浓度为100 ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液20.0 μL，振摇混匀。加入 10.0 mL 乙腈、 35.0 mL 二氯甲烷， 剧烈振摇7 min，静置20 min，将下层溶液转移至150 mL梨形瓶中；继续向分液漏斗中加入 10.0 mL 乙腈、35.0 mL 二氯甲烷，剧烈振摇7 min，静置20 min，合并下层溶液于上述150 mL梨形瓶中，于(42±2) ℃水浴中减压浓缩至近干。用5 mL乙腈溶解残留物，振荡混匀。将梨形瓶中的溶液转移到活化过的中性氧化铝小柱上，用4 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，于(42±2) ℃的水浴中旋转蒸发至近干，向梨形瓶中加入1.0 mL 乙腈-乙酸铵缓冲溶液(1∶1,V∶V)，涡旋振荡充分溶解后，经 0.22 μm针孔式滤膜过滤后上机检测。

1.6 仪器条件

色谱条件：Waters BEH C18反相色谱柱(2.1 mm×100 mm，粒度 1.7 μm)；柱温为35 ℃；进样量为1 μL；流动相为乙腈-0.1 % 甲酸水溶液(1∶1，V/V)；流速为0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；去溶剂气温度为500 ℃；雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量为900 L/hr；碰撞气为氩气，输出压力为0.06 MPa；离子模式为多反应监测扫描模式；选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表1。

表1 氘代孔雀石绿、孔雀石绿、氘代结晶紫、结晶紫的质谱条件Tab.1 Mass spectrometry parameters for MG-D5 、MG 、CV- D6 and CV

注：带*的为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 萃取方案的优化

根据文献[16]，本实验选用乙腈和二氯甲烷作为水样中MG和CV的提取溶剂。乙腈作为辅助萃取溶剂，用量为10 mL，可以提高二氯甲烷对MG和CV的提取效率[17]。

采用正交试验，对影响加标回收率的3个因素(萃取时间、萃取次数和萃取试剂用量)进行三因素三水平的实验[18]，确定萃取方案。按照表2 的正交试验来确定这些因素和水平对加标回收率的影响，选取最优化的萃取方案，加标量均为5.0 ng/L，每个方案平行3次，求出回收率平均值，结果见表3 。

表2 正交实验因素水平表Tab.2 Table of factor and level of orthogonal experiment

注：A为二氯甲烷用量；B为萃取时间；C为萃取次数，下同。

表3 不同萃取方案的回收率Tab.3 Recoveries of different extraction programmes n=3

根据表3所得的MG回收率和CV回收率，计算K值和极差R，Ki表示任意列上水平号为i时所对应的试验结果之和,极差R=Kmax-Kmin,结果如图1、图2和图3。

本实验通过对二氯甲烷用量、萃取时间和萃取次数进行正交试验，确定了优化的萃取方案。由图1、图2和图3可知，不同因素影响回收率的程度为：二氯甲烷用量>萃取时间>萃取次数，这对MG和CV回收率的影响是一致的，最佳组合方案为： A3B2C2 ，对应的实验条件分别为二氯甲烷用量35 mL、萃取时间5 min、萃取次数2次。在此条件下，三次平行实验MG的平均回收率为97.8%，CV的平均回收率为95.6%。另外液液萃取操作时，静置分层10 min，使有机相和水相分层明显，便于收集乙腈-二氯甲烷混合物。

图1 孔雀石绿正交实验的K值A为二氯甲烷用量；B为萃取时间；C为萃取次数，下同。Fig.1 K value of MG orthogonal experimentA represents amount of dichloromethane; B represents time of extraction; C represents extraction times. The same below.

2.2 固相萃取小柱的确定

养殖水体中色素、藻类和浮游生物等含量较高，采用适当的固相萃取小柱可以去除杂质净化上机液，保护色谱和质谱系统，减少基质效应对检测的影响。在研究水中MG和CV的检测方法时，参考文献[9,12,19]，对PRS小柱、MCX小柱(混合型阳离子交换柱) 和中性氧化铝小柱的净化效果进行了比较，这3种常用的固相萃取小柱对MG和CV的回收率均在70%以上，基质效应对检测影响均较小。与水产品和沉积物等基质相比较，养殖水体杂质较少，使用性价比较高、适用性较广的中性氧化铝小柱即满足检测要求，因而本研究采用中性氧化铝小柱作为萃取液的净化小柱。

2.3 标准曲线的绘制

MG和CV的混合标准上机溶液中，质量浓度梯度依次为0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 10.0、和20.0 ng/mL，其中同位素内标的含量均为2.0 ng/mL。按照1.6节的仪器条件上机检测，数据处理选用内标法，MG的标准曲线方程为y=0.916x-0.224,线性相关系数R为0.998；CV的标准曲线方程为y=0.964x+0.033 3，线性相关系数R为0.998(y为外标和内标峰面积的比值，x为外标和内标浓度的比值)。结果表明：MG和CV在0.2～20.0 ng/mL范围内线性关系良好。

2.4 方法的定量限

采用空白样品添加低浓度的标准溶液，按1.5、1.6节进行测定，以信噪比S/N≥10[20]确定MG和CV的定量限(LOQ)均为2.0 ng/L，满足MG和CV低浓度残留量的检测要求。

2.5 准确度和精密度

本方法的准确度通过测定加标样品的平均回收率来确定，精密度通过计算平均回收率的相对标准偏差来确定。加标样品的添加水平分别为2、4、10、20 ng/L，每个添加水平做6个平行样品，分3批次进行准确度和精密度实验[21]，测定结果见表4。在取样量为100 mL、MG和CV的添加水平为2.0～20.0 ng/L时，平均回收率为89.9%～102.0%，相对标准偏差小于10%，说明该方法具有较高的准确度和较好的精密度，满足水中MG和CV残留的检测要求。质量浓度为0.2 ng/mL的MG和CV标准上机溶液的质谱总离子流图见图4。

图3 孔雀石绿和结晶紫正交实验的R值Fig.3 R value of MG and CV orthogonal experiment

图4 孔雀石绿和结晶紫的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of MG and CV

n=6

3 结论

本研究建立了通过液相色谱-串联质谱同时检测养殖水体中MG和CV残留的方法。该方法对水中MG和CV的含量可以准确定量，定量限均为2.0 ng/L，线性范围为0.2～20.0 ng/mL，批内和批间相对标准偏差均小于10%，重复性较好，满足养殖水体中MG和CV的检测要求。

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