饲料中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的测定——超高效液相色谱-串联质谱法

张天姝，马 雷，玄 兵，孙世峰

（1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁省沈阳市兽药饲料监察所，辽宁 沈阳 110016；3.辽宁省锦州市兽药饲料监察所，辽宁 锦州 110016；4.辽宁省沈阳市动物卫生监督所，辽宁 沈阳 110000）

激素是一类由动物腺体产生或人工合成的可调，节生物机体细胞生长、分化和代谢的化学物质。激素具有使动物体肌肉扩增、促进生长和育肥的作用，自20世纪50年代起被广泛用作动物生长促进剂。玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚是人工合成的非类固醇同化性激素，曾被官方批准用于畜牧业养殖过程中，用来提高饲料转化率及促进牲畜生长。20世纪80年代左右，毒理学研究表明这些药物会引发癌症，为了防止这些激素随畜产品进入人体，各国陆续颁布法令禁止在畜牧业生产过程中使用。2002年，农业部公布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中，明确规定玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚为禁用兽药。

目前已有应用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法分别检测动物组织和牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的报道,但是饲料中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的测定方法还很少有报道，国家标准更是没有。本试验应用超高效液相色谱-串联质谱法同时检测饲料中玉米赤霉醇及代谢物和己烯雌酚含量，为保证畜产品质量安全，有必要建立一种即灵敏又准确的液质联用法测定饲料中非类固醇同化激素含量，为食品安全和人们身体健康提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器Waters ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相色谱仪、涡旋仪（Heros RS-2）、超声仪（KQ-250DB）、高速离心机（Biofuge STRATOS Centrifuge）、MilliQ超纯水器（美国Millipore公司），氮吹仪（ANPEL）。

1.1.2 对照品玉米赤霉醇（对照品来源为Dr.E公司）、玉米赤霉酮（对照品来源为witega公司）、己烯雌酚（对照品来源为Dr.E公司）。

1.1.3 对照品溶液的配制分别精密称取玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚3种对照品，以乙腈为溶剂配成浓度各约为 200 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL标准储备液，玉米赤霉酮和己烯雌酚标准贮备液2～8℃冷藏保存，玉米赤霉醇-20℃冷冻保存。准确吸取适量上述标准储备液，用50%乙腈水稀释成浓度为50 ng/mL对照品上机液。

1.1.4 试剂甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）。试验用水均为超纯水。

1.2 样品前处理取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL的离心管中，加提取液（正己烷:乙酸乙酯溶液=85:15）20 mL，涡旋 15 s，室温中超声 20 min，10 000 r/min离心10 min。取上清液10 mL于50 mL离心管中，40℃下氮气吹干，残余物用正己烷溶液，备用。

样品备用液全部过经10 mL正己烷活化的羟基净化柱，5 mL正己烷淋洗，用真空泵抽干10 min，5 mL 50%乙腈水溶液洗脱，充分涡旋溶解后，过滤膜，灌瓶，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件Waters HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm（i.d.），粒径1.8 μm），柱温40℃，流动相流速为0.3 mL/min，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient phase for UPLC

1.3.2 质谱条件电喷雾正离子扫描（ESI-），毛细管电压3.0 KV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流速650 L/h，锥孔锥孔气流速50 L/h，碰撞气为高纯氩气，光电倍增管电压650 V。采用MRM多反应监测方式，母离子（Q1）/子离子（Q3）离子对及各组分保留时间见表2。

2 结果与讨论

2.1 母离子和子离子的选择以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，采用MS-Scan模式进行全扫描，确定母离子质量数，优化母离子使其获得较高的丰度。选定母离子后再采用Daughter-Scan方式对其子离子进行扫描，通过优化碰撞能量选择两个丰度较高的子离子作为定性和定量离子。3种目标化合物的离子对、锥孔电压及碰撞能量的优化参数见表2。

2.2 质谱测定和液相色谱优化条件的选择

表 2目标化合物的UPLC-MS/MS检测条件Table 2 UPLC-MS/MS acquisition parameters for target compounds

2.2.1 质谱测定质谱的毛细管电压、离子源温度、脱溶剂气温度和流速、锥孔电压、碰撞能量在兼顾所有目标化合物都有良好的响应信号情况下进行优化。

2.2.2 液相色谱条件采用甲醇可以使具有相似保留特性的激素在反相色谱柱上有良好的保留，因此选用Waters HSS T3 100 mm色谱柱，以甲醇和水溶液作流动相，在流速为0.3 mL/min的梯度条件下分3种药物得到了良好的分离效果。3种药物的保留时间参见表2。

2.3 样品前处理方法的优化玉米赤霉醇以及代谢物与己烯雌酚的化学结构有很大的不同，故要求前处理方法必须兼顾3种目标化合物都能得到很好的回收率，并且净化基质，减少干扰。饲料中检测这3种目标化合物的报道很少，查阅动物组织和牛奶中对其的研究报道，不同文献有所不同。经过大量试验分析，对检测饲料中的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的前处理方法进行优化。

2.3.1 提取方法试验考察了正己烷、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯等不同有机试剂的提取效果，其中甲基叔丁基醚和正己烷-乙酸乙酯效果较好，进一步比较了甲基叔丁基醚与不同比例的正己烷-乙酸乙酯（80:20、85:15、90:10、95:5）的提取效果，根据回收效果表明正己烷-乙酸乙酯（85:15）时提取效果最佳。

2.3.2 净化方法固相萃取净化柱选用Agilent Technologies的Bond Elut-2OH净化柱。根据不同净化柱的性能和净化条件进行比较试验。试验表明Bond Elut-2OH净化柱与HLB反相净化柱相比较具有较好的净化效果，过程简单，活化和淋洗的试剂相同，回收稳定，杂质干扰小。因此本研究选择Bond Elut-2OH净化柱。

2.4 基质效应基质效应在质谱分析当中是非常普遍存在的现象，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚受到样品的基质效应因素影响，而这种效应在液质当中有着抑制离子化过程的影响，从而导致了分析的准确性，所以我们分别用50%乙腈和空白样品溶液稀释的一系列标准溶液，进行LC-MS/MS对比来检测，基质效应可以通过样品基质中待测物的峰面积与纯溶液中待测物峰面积的比值计算。结果表明3种目标化合物在离子化的过程中有细微的信号减少，而在相应的样品检测中，采用了空白基质提取液配制标样来抵消基质效应。不同的饲料基质所产生的基质效应大小都不一样，所以在检测时要测定不同的饲料，要选择对应的饲料基质来配制基质添加标准溶液。

在本试验的过程中，发现基质效应普遍存在。因此在日常的例行检测中，最好能够对饲料进行分类检测，即对每类饲料做一个基质标样，减少由于不同基质从而产生的干扰，如果有可能采用强化添加的方式，确保检测结果的准确性。

2.5 线性方程、检出限和定量限不同饲料样品的组成比较复杂，其中含有大量的的蛋白质、脂肪和盐等干扰物，会对检测方法的灵敏度和准确性造成一定的影响，进而影响试验的检测结果。不同的基质效应对检测方法的灵敏度造成的影响也不同，为了降低基质效应对定量准确度的影响，本试验绘制基质校正标准曲线来进行定量。

分别精密量取适量玉米赤霉醇，玉米赤霉酮和己烯雌酚，制得浓度为2、5、10、20、50、100、200 ng/mL系列对照溶液，供高效液相色谱-串联质谱法测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.6 方法的灵敏度

表3 目标化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Calibration curves，correlation coefficient、LOD and LOQ of target compounds

2.6.1 空白试料 按相同的步骤处理后，测定结果表明，在相应的保留时间，空白试料对所测分析物无干扰。

2.6.2 检测限（LOD）与定量限（LOQ） 添加适量混合标准溶液于2 g空白样品中，经提取净化后测定，根据所测药物的S/N＞3（按PtP算）计算3种药物在玉米、DDGS、配合饲料、精料补充料中检出限为10 μg/kg，S/N＞10计算3种药物在玉米、DDGS、配合饲料、精料补充料中定量限20 μg/kg。10 μg/L标准溶液在MRM监测模式下的选择离子流图见图1。

2.7 方法回收率和精密度考察在确定样品预处理方法后，用各类空白饲料样品作为测试对象，进行加标回收率试验，以考察方法的准确度和重现性。配制10、20和50 μg/kg 3个浓度的试样，每批次内同一浓度做5次平行试验，平均回收率为61.7%～99.4%之间，相对标准偏差均＜15%。计算结果见表4和表5。

图1 MRM监测模式下3标准溶液的选择离子流图（10 μg/L）Fig.1 Selected ion chromatogram of standards in MRM of target compounds

3 结论

本研究采用UPLC-MS/MS方法检测玉米、DDGS、配合饲料、精料补充料等饲料产品中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚，本方法简便，灵敏度高，结果准确，重复性好。方法检测限和定量限低，能满足我国对饲料中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的监测需要。

表4 方法的回收率及精密度（n=5）Table 4 Results of recovery experiments and RSD%

表5 方法的回收率及精密度（n=5）Table 5 Results of recovery experiments and RSD%

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