磁化水对根瘤菌和生防枯草杆菌的生物效应

皇甫彩娟，董 楠，陆 茜，罗 明 ,李卫军

(1.新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学 草业与环境科学学院，乌鲁木齐 830052)

经过磁场静止处理或以一定流速经过磁场、垂直切割磁力线后的水称之为磁化水。在洛伦兹力的作用下，磁化后的水分子间氢键减弱、结构状态发生改变、聚合度降低，导致水的活性增加，渗透力、电导率、溶解度、透光率、挥发性及 pH 等诸多物理化学性质都发生变化[1]。磁化水技术装置简单，节能环保，现已应用于防治水垢[2]、污水处理[3]和农业[4]等领域，并取得了一定效益。近年来，磁化水在农业生产中的应用越来越引起国内外广泛关注和日益深入的研究。研究表明，在优化磁场的作用下，磁化水浸种可增加种子活性、提高抗逆性、促进幼苗生长和营养吸收利用[5-6]；磁化水灌溉应用在棉花、玉米、番茄、小麦和蚕豆等[7-11]作物上能提高产量和品质，还具有改善土壤肥力、提高土壤脱盐率等功效[12-14]。近年来，将磁化水与滴灌相结合的磁化水滴灌成为一种新型节水技术在棉花、小麦、苜蓿[15]等作物栽培中试验应用，能显著提高水分利用效率，在水资源短缺的中西部干旱地区农业生产中具有良好的应用前景。目前，磁化水处理对微生物的生物生长和代谢影响的研究鲜有报道。马放等[16]研究发现磁场对硝化细菌生长有明显的促进作用，而对反硝化细菌的生长则表现出一定的负效应。而王祥三等[17]试验得出，磁场强度为2 100 Gs 的磁处理水可使70%以上细菌死亡，存活下来的细菌发生变异，具有更强的生存能力。研究发现，不同磁场强度、作用时间、磁化次数(频率)处理的磁化水，针对不同微生物菌株的影响不同，会产生不同的效果。在一定情况下磁化水对微生物生长起促进作用，但超过一定范围可能会产生负效应。因此，如何优化磁化水技术、促进有益微生物生长，抑制和减少有害微生物的危害是磁化水应用中亟需解决的问题。本试验以根瘤菌、生防芽孢杆菌 2 种益微菌为研究材料，研究不同磁化水处理对有益微生物生长及功能的影响，明确磁化水的生物效应，为磁化水技术在农业生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 磁化器及磁化水的制备

4 000 Gs采用外置式强磁水处理 JBMS-cw 50(上海长创水处理设备有限公司)，20 000 Gs磁化器采用外置式强磁水处理 DW-II(哈尔滨大禹磁处理开发有限公司)。以自来水(水流速为 3 m·s-1)分别制备流水切割4 000 Gs 磁化处理1～3次的磁化水和20 000 Gs磁化处理1次的磁化水。

1.2 供试的苜蓿种子

供试种子为‘新牧一号’杂花苜蓿，由新疆农业大学草业与环境科学学院提供。

1.3 供试菌株

根瘤菌株：苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)XGL026，为新疆农业大学农学院实验室(以下简称本实验室)在前期研究中从新疆紫花苜蓿根瘤中分离、筛选出的固氮活性高、抗逆性强、具有促生性能的苜蓿根瘤菌株。S.melilotiXGL026-GFP为本实验室采用三亲本杂交法构建的携带有绿色荧光蛋白基因GFP和四环素抗性基因的标记菌株。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 2-4菌株：为本实验室分离、保存的对棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)具有较强抑菌活性的拮抗菌株。

棉花黄萎病菌株：由新疆农业大学植物病理系提供。

1.4 培养基

根瘤菌、枯草杆菌培养分别采用甘露醇酵母汁培养基[18]和牛肉膏蛋白胨培养基[19]；棉花黄萎病菌孢子液培养采用查氏培养基；抑菌活性测定采用马铃薯蔗糖培养基(PDA)[19]。

1.5 磁化水对苜蓿根瘤菌生长的影响

分别用4 000 Gs 磁化器处理 1次(T1)、2次(T2)、3次(T3)的磁化水和普通水(CK)制备 YMA 培养基，分装于三角瓶中(装液量80 mL/250 mL)，每处理重复3次。高压蒸汽灭菌后，接种活化后的根瘤菌种子液(接种量 1 %)，置于恒温摇床中 120 r·min-1，30 ℃振荡培养48 h。每隔 8 h分别测定各处理根瘤菌的生长状况。测定各处理培养液的 OD600nm值，同时用稀释平板测数法测定根瘤菌活菌数。按10 ×倍比对各处理培养液梯度稀释后，取 200 μL 合适稀释度的稀释液均匀涂布于 YMA 平板上，于恒温培养箱中 30 ℃倒置培养 48 h，计数菌落数，计算活菌数。

活菌数(cfu·mL-1)培养液=计数皿菌平均菌落数×稀释倍数/接种量

1.6 磁化水灌溉对苜蓿接种根瘤菌结瘤数的影响

1.6.1 接种液的制备 将根瘤菌S.melilotiXGL026-GFP 菌株活化后，接种至由 T1、T2、T3 磁化水和普通水配制的 YMA 液体培养基中(含四环素 10 μg·mL-1)，120 r·min-1，30 ℃，振荡培养至菌液OD600nm≈1.0。

1.6.2 盆栽苜蓿接种根瘤菌 将土壤和蛭石混和(体积比 1∶1)灭菌后，按每盆15 kg 干土装入花盆中，其底部放置托盘接渗漏液，防止养分、水分流失。将供试苜蓿种子表面消毒后催芽，选取露白均匀一致种子，按每粒200 μL接种菌液。每盆播种 5 粒种子，出苗后每盆选留生长一致的 3 株苗，每处理 14 盆苗。将花盆放置在日光温室内，自然光照，适时浇水。

1.6.3 磁化水灌溉 对各接种处理分别用 T1、T3 磁化水灌溉接种处理的苜蓿盆栽苗，以无菌水灌溉接种处理的苜蓿盆栽苗作为对照，每处理 7 盆。50 d 后调查苜蓿结瘤情况。

1.7 磁化水对枯草芽孢杆菌生长的影响

分别用4 000 Gs 磁化处理 1次(T1)、2次(T2)、3 次(T3)的磁化水和20 000 Gs磁化处理1次(T4) 的磁化水和普通水(CK)制备牛肉膏蛋白胨培养基，分装于三角瓶中(装液量80 mL/250 mL)，每处理重复3次。灭菌后，接种活化后的根瘤菌种子液(接种量1 %)，置于恒温摇床中 120 r·min-1，30 ℃ 振荡培养48 h。每隔 8 h 分别测定各处理根瘤菌培养液的OD600nm值和活菌数。

1.8 磁化水培养的枯草杆菌对棉花黄萎菌的抑菌效果

1.8.1 棉花黄萎菌孢子液的制备 将黄萎菌活化后, 挑取菌块接种于察氏液体培养基中，180 r·min-1，25 ℃恒温摇床培养5～7 d，4层纱布过滤菌丝, 在显微镜下用血球计数板将滤液中孢子数调至1×106个·mL-1。

1.8.2 枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病菌抑菌活性的测定 用 PDA 培养基制备双层平板。取黄萎病菌孢子悬液200 μL均匀涂布平板，用灭菌的打孔器在培养基平板周围打孔(直径为 5 mm)。向孔洞内分别加入20 μL磁化水和普通水培养的枯草芽孢杆菌接种液，28 ℃ 恒温培养箱内倒置培养3～4 d。观察抑菌圈产生情况。

1.9 数据分析

采用 Excel 2003 和 SPSS 19.0 软件对试验所得的数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 磁化水处理对苜蓿根瘤菌S.meliloti XGL026生长的影响

用磁化水和普通水制备的培养基培养苜蓿根瘤菌S.melilotiXGL 026，定期检测根瘤菌菌液浓度及活菌数的动态变化(图 1、图 2)。结果表明，在普通水培养基中，接种后培养8 h的菌体浓度迅速增长至OD值0.320，48 h后达到最高生长量(OD600nm=1.534)。在4 000 Gs 磁化 1 次(T1)、 2 次(T2)、3次(T3)的磁化水培养基中，菌体生长更为迅速，培养8 h的菌液OD值分别达0.674、0.923、1.730。T1、T2磁化水培养至48 h 时菌体浓度达到最高，OD值分别为1.810、

图1 磁化水处理对根瘤菌菌液浓度的影响Fig.1 Effect of magnetized water treatment on theconcentration of S.meliloti XGL026

图2 磁化水处理对根瘤菌活菌数的影响Fig.2 Effect of magnetized water on the viablebacteria counts of S.meliloti XGL026

1.900，T3处理达到菌体最高生长量的时间提前至32 h(OD600nm=2.016)。磁化水对枯草杆菌活菌数影响的测定结果与菌液浓度变化相符合。由图2可见，在磁化水培养基中，根瘤菌生长繁殖速度加快，0～48 h的培养周期中活菌数均高于普通水对照。培养48 h时，T1处理和普通水对照活菌数均达到最高值，T1较对照增加11.02%；T2、T3处理在40 h时活菌数达到最高值，较对照分别提高76.92%、72.47%。

2.2 磁化水对苜蓿根瘤菌结瘤的影响

在盆栽苜蓿上接种由绿色荧光蛋白基因GFP标记的根瘤菌株S.melilotiXGL 026-GFP，以磁化水或普通水灌溉，定期检测其在苜蓿根上的结瘤数(表1)。结果表明，接种磁化水培养的根瘤菌能显著增加苜蓿结瘤数(P<0.05)，各处理的结瘤数每株增加 5～11 个(平均8个)，其中接种 T3 磁化水培养的根瘤菌+T3磁化水灌溉苜蓿处理(T3培养+T3磁化水灌溉)的结瘤数增幅最显著(P<0.01)。接种后采用磁化水浇灌的苜蓿结瘤数略高于用普通水浇灌，但差异不大(P>0.05)。

表1 磁化水处理对苜蓿结瘤数的影响Table 1 Effect of magnetized water on the nodule number of alfalfa

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note:Different lowercase letters on the table indicate significant difference at the 0.05 level,different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level.The same below.

2.3 磁化水对生防枯草杆菌B.subtilis 2-4菌株生长的影响

测定生防枯草杆菌在磁化水培养基中菌体浓度和活菌数的动态变化(图3，图4)。结果表明，在普通水培养基中，接种后培养8 h的菌体浓度迅速增长至OD值0.833，24 h后即达到最高生长量(OD600nm=1.816)；而4 000 Gs 磁化 1次(T1)、 2次(T2)、3次(T3)和20 000 Gs磁化 1 次(T4)的磁化水培养基中，菌体浓度增长迟缓，培养8 h的OD值依次为0.483、0.189、0.234和0.221，达到菌体最高生长量的时间延迟到32 h，OD值分别为1.754、1.83、1.437和1.256，说明T1、T2磁化水在枯草杆菌生长前期对菌体生长繁殖具有一定抑制作用，但随着生长期延长抑制作用减弱，对菌体生长量的影响不大。T3、T4处理则对枯草杆菌的整个生长期都有明显的抑制作用，并显著降低其生长量，其中T4处理达到极显著水平(P<0.01)。磁化水对枯草杆菌活菌数影响的测定结果也显示相似的特点。由图4可见，在磁化水培养基中，接种后培养8 h的枯草杆菌增长速度较普通水降低。培养32 h后活菌数达到最高值，T1、T2处理较对照增加6.48%、8.48%，但T3和T4较对照降低33.17%和93.52%。

2.4 磁化水处理对枯草芽孢杆菌B.subtilis 2-4菌株抑菌效果的影响

根据前期试验结果，选取对枯草芽孢杆菌生长有促进作用的T1处理和有显著抑制作用的 T3、T4处理，测定其对棉花黄萎菌抑菌效果的影响(表2)。从表2可以看出，与普通水对照相比，T1磁化水处理能提高枯草杆菌的抑菌作用，抑菌圈半径较对照增大。而T3和T4磁化水处理，其抑菌圈半径较对照分别减小44.5%和49.6%，对棉花黄萎菌的抑菌效果显著减弱(P<0.01)。

图3 磁化水对枯草杆菌2-4细胞浓度的影响Fig.3 Effect of magnetized water on the cellconcentration of B.subtilis 2-4

图4 磁化水对枯草杆菌2-4活菌数的影响Fig.4 Effect of magnetized water on the visablebacteria counts of B.subtilis 2-4

处理Treatment抑菌圈半径/mmTheantibacterialcircleradius普通水对照 Theordinarywater(CK)17．19±0．008cC4000Gs磁化1次(T1) 4000Gsmagnetizationforonetime(T1)17．32±0．001cC4000Gs磁化3次(T3) 4000Gsmagnetizationforthreetimes(T3)9．54±0．001bB20000Gs磁化1次(T4) 20000Gsmagnetizationforonetime(T4)8．66±0．001aA

3 讨论及结论

3.1 磁化水处理对苜蓿根瘤菌的生物效应

根瘤菌与豆科植物共生结瘤是自然界中最高效的固氮体系，对植物氮素营养的持续供给、土壤改良、土壤肥力的提高和保持起到举足轻重的作用，在农业生产中具有重要意义。笔者[20]前期的试验结果证明，20 000 Gs恒定磁场处理的磁化水对苜蓿根瘤菌生长有显著的抑制作用，活菌数减少至普通水培养基的86.96%～65.72%，20 000 Gs磁化3次的处理抑制效果达到极显著水平(P<0.01)。本研究结果表明，4 000 Gs 磁场强度下磁化1～3次的磁化水对苜蓿根瘤菌生长有明显促进作用，增加其菌体浓度，最大生长量较对照增加11.02%～76.92%(平均43.97%)，磁化2次、3次的处理缩短了到达最高活菌数的时间。磁化水不仅影响根瘤菌生长，还会对其在土壤中的定殖、侵染结瘤和固氮效率产生影响。何媛等[20]发现采用20 000 Gs 恒定磁场的磁处理水灌溉，接种根瘤菌在苜蓿根部土壤的存活、定殖量下降，单株结瘤数较对照平均减少46.4%(P<0.01)，地上、地下部分的固氮率分别降低21.06%和20.48%，固氮量分别降低26.64%和37.50%[23]。本研究通过苜蓿盆栽试验发现，接种由4 000 Gs的磁处理水培养的根瘤菌能显著增加苜蓿结瘤数(P<0.05)，磁化3次处理的增加幅度最大。研究结果明确了不同磁场强度下的磁化水对苜蓿根瘤菌产生的效应差异极大，20 000 Gs的较“高”磁场强度磁处理水对根瘤菌的生长及存活定殖、结瘤和固氮均产生负效应，而4 000 Gs的较“低”磁场强度下的磁处理水则对苜蓿根瘤菌的生长、结瘤有明显的促进作用。4 000 Gs的磁处理水对苜蓿根瘤菌的田间固氮效应及对苜蓿产量和品质的影响将在今后进一步试验研究。大量研究表明，利用优良根瘤菌株接种是苜蓿高效生产的重要举措，而接种根瘤菌在土壤中的存活、稳定定殖和高效结瘤是发挥其固氮效能的关键。目前，对根瘤菌的应用研究均在常规灌溉模式下进行，对磁化水灌溉条件下根瘤菌的应用研究鲜见报道。本研究结果为在磁化水灌溉条件下苜蓿生产中应用根瘤菌提供了参考。

3.2 磁化水处理对枯草芽孢杆菌的生物效应

枯草芽孢杆菌为好氧产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，是一种理想的生防细菌资源，被广泛研究和商业化生产，目前已在黄瓜、辣椒、水稻、小麦、玉米、棉花等多种农作物病害防治中得到成功的应用。谢捷等[21]发现，磁场强度为 500 Gs 的磁处理水对枯草杆菌生长有一定促进作用，但1 000 Gs、2 500 Gs的磁处理水对枯草杆菌的生长有极明显的抑制作用(P<0.01)，而800 Gs 的磁处理水对枯草芽孢杆菌的生长没有影响。本试验发现，4 000 Gs 、20 000 Gs的磁处理水对枯草杆菌的生长速度具有不同程度的抑制作用，其中4 000 Gs 磁化 3 次和20 000 Gs磁化 1 次的磁处理水可显著降低其生长量。本试验得出的抑制和促进枯草杆菌的磁处理水的磁场强度与谢婕等[21]的结果有较大区别，可能是供试菌株不同，磁化条件不同，故所得结论也不尽相同。宋健等[22]发现，28～50 Gs 的磁处理水可以提高苏云金芽孢杆菌G-02菌株的产孢量，43 Gs磁场处理2～12 h 的磁化水培养基中产孢量最大、毒力效果增强[22]。适当磁化强度的磁化水能显著提高绿僵菌液生分生孢子产量，但磁化水生产的分生孢子液对马尾松毛虫的毒力与普通水对照并无显著差异[23]。本试验结果表明，4 000 Gs磁化1次磁处理水对枯草芽孢杆菌的抑菌能力有一定增效作用，4 000 Gs磁化3次和20 000 Gs磁化1次的磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎菌的抑菌效果显著减弱(P<0.01)。本研究仅开展了室内试验，磁化水能否对枯草杆菌2-4菌株田间防病效果产生影响，还需后续的盆栽、小区和大田试验做进一步研究证实。

本研究结果进一步证实不同物理特性的磁场，如磁场强弱、作用时间、磁化次数(频率)、原水水质以及水的流速等诸多因素都会影响磁化水的性质，针对不同的微生物菌株所起引的生物学效应具有很大差异[24]。磁化水的生物效应是磁场和生物共同作用的结果，其过程十分复杂。目前磁化水对微生物生物效应的研究还十分有限，其机理至今仍处于假设和论证阶段，尚无定论。今后很有必要对磁化水的作用机制做进一步的深入探讨和研究，为磁化水的应用奠定科学基础。

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