胶原蛋白酶解制备肽工艺研究进展

张崟，郭思亚，熊伟，向鹏妍，吴婷，孟婧，张婷

(成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106)

畜禽及水产品加工副产物，如畜禽骨、畜禽皮、鱼皮、鱼鳞、鱼头、鱼骨、鱼鳍等，其中含有丰富的胶原蛋白。由于胶原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的含量较高，所以常用其制备氨基酸或作为补充甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的蛋白质原料。近年来，有关胶原蛋白功能性的最新研究结果发现，胶原蛋白水解所得的胶原肽，不仅表现出很好的可消化性，而且还具有保护胃黏膜、抗氧化、抗溃疡、抗衰老、抗过敏、降血压、促进软骨再生、促进角膜上皮细胞的修复和生长，促进皮肤胶原代谢、免疫调节等诸多独特的生理活性[1-3]。因此，水解胶原蛋白制备肽的工艺及胶原肽的功能性研究越来越多地受到国内外科研机构的重视。

目前，常用的制备胶原肽的方法主要有酸法、碱法和酶法[4,5]。酸法和碱法均采用化学试剂促使胶原蛋白分解产生小分子肽。这两种水解方法不仅过程难以控制，而且反应比较强烈，会造成氨基酸变性，产生有毒物质等不利结果[6]。因此，使用可替代化学法的酶法水解胶原蛋白技术日益受到重视。酶法水解胶原蛋白不仅反应条件温和，具有较高的回收率，而且水解反应速率快，对环境污染较小，所得胶原肽较酸法和碱法更安全。因此，被广泛应用于功能性食品、化妆品及其他产品开发[7]。为了更好地促进酶法水解胶原制备肽工艺改进和对酶解肽功能性的研究，本文对近年来有关酶法水解胶原蛋白制备肽的工艺进行了对比分析。

1 胶原蛋白概述

胶原蛋白又名胶原质，是一种白色、不透明、无支链的纤维状结构蛋白质。胶原分子有着典型的长且坚韧的三螺旋结构，由2条α1肽链和1条α2肽链组成。3条α肽链交互缠绕形成绳索状的超螺旋结构。每条肽链的序列为连续重复的Gly-X-Y(X为脯氨酸，Y为羟脯氨酸或羟赖氨酸)[8]。

2 酶解胶原肽的功能性及用途

胶原蛋白独特的三股超螺旋结构使其具有十分稳定的化学性质，微弱的酸很难使其分解。因此胶原蛋白难以被人体直接消化利用。但是，将胶原蛋白水解，形成分子量较小的胶原多肽后，可显著提高其生物利用性，更有利于被人体吸收和利用[9]。酶法水解胶原蛋白制备胶原肽的原理是通过蛋白酶，如胶原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等对其进行水解，得到多肽[10]。

常见的酶解胶原蛋白制备胶原肽的反应条件、所得肽的功能性及用途见表1。酶解胶原蛋白所得肽具有抗氧化、ACE抑制、抗菌活性，其主要用途包括清除自由基、防止脂质过氧化、降血压及抗菌。可将酶解胶原肽添加到点心、乳制品及其他食品中，改善食品的营养价值[11]。还有将胶原蛋白肽添加于饮料中，制作体能恢复性饮料的报道。近年来，酶解胶原蛋白制备胶原肽的研究已全面展开，而且随着国内外对胶原蛋白肽研究的不断深入，胶原肽的功能性及其利用价值将会被更多地发掘。

表1 酶解胶原蛋白的产物特性及其用途Table 1 Characteristics and applications of enzymatic hydrolysates of collagen

注：ACE指血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme)。

3 酶解胶原蛋白工艺分类

胶原蛋白的来源及其类型不同，其中的氨基酸构成及多肽的种类会出现差异。在采用酶法水解胶原蛋白时，酶的选择和酶解工艺对胶原肽的制备有重要影响。通过分析近年来国内外胶原蛋白的酶解工艺发现，目前酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解和多酶水解两种方法，其中多酶水解法又分为混合酶水解法或分步酶水解法。酶解胶原蛋白的工艺选取通常应考虑要开发的产品对肽分子量的要求。如果欲得到分子量较小的胶原多肽，一般采用多酶水解法，反之则采用单酶水解法[24]。

3.1 单酶水解法

在单酶水解胶原蛋白工艺建立上，国内外研究人员多在单因素实验基础上，采用正交实验或响应面法设计实验方案，然后建立最优的酶解工艺[25-27]。采用单酶水解胶原蛋白的酶解工艺及酶解效果比较见表2。

表2 单酶酶解胶原蛋白工艺比较Table 2 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with one proteinase

续 表

由表2可知，在原料方面，涉及的畜禽加工副产物包括畜禽骨、皮；水产加工副产物包括鳞、皮、肉及骨，其中畜禽加工副产物中酶解骨胶原制备肽的工艺较多；在水产品加工副产物方面，水解鱼鳞胶原的报道较多。

在酶的来源方面，以外加蛋白酶居多，其次是采用内源性蛋白酶水解胶原制备肽。酶用量、酶解温度、酶解时间及pH对酶解效果影响大，以鱼鳞为例，采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，两者的水解度差异近2倍。

畜禽骨的水解度在1.613%～32.46%变化。在水产加工副产物方面，可能受原料和酶解条件的共同影响，水解度的变化较大，在1.46%～36.2%变化，其中罗非鱼下脚料的水解度最高。在水解产物功能性方面，单酶水解效果多采用水解度评价水解效果，其次是胶原蛋白提取率、自由基清除率及ACE抑制活性。

3.2 混合酶水解法

由于酶的专一性，采用单酶水解胶原蛋白时，只能分解其中一些具有特定结构的肽键。因此，底物结构对单酶水解效果影响较大。随着水解时间增加，水解度不会再增加，而且水解程度受限，所得胶原肽的分子量一般较大。为了避免单酶水解的这一缺陷，近年来出现了采用多种酶混合法对胶原蛋白进行水解的报道(见表3)。多种蛋白酶的混合，可以发挥不同酶的水解特性，优势互补，实现对胶原蛋白的多位点分解。因此，所得酶解产物的水解度较高，有利于提高底物转化率，缩短水解时间[64]。多酶水解还可以减少因为单酶水解不彻底，造成疏水性氨基酸含量较高而引起酶解液苦味较重[65]、酶解液风味不足、腥味较重等不利结果[66,67]。

表3 混合酶水解胶原蛋白工艺Table 3 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with poly-proteinase

由表3可知，在原料方面，混合酶解用到的畜禽副产物包括猪骨、鸡骨及鸡皮、猪皮，水产品加工副产物方面有鱼皮及鱼鳞。在酶的混合方式方面，以双酶酶解居多，其次是三酶水解，尚未见有4种或更多酶复合酶解的报道。比较表2和表3中猪皮的水解度可知，多酶酶解使猪皮的水解度提高了近1倍，由单酶水解度9.55%到双酶水解度17.7%。在酶解效果评价方面，目前报道的文献主要有水解度和肽回收率对酶解效果进行评价，未见对酶解肽的功能性评价。

3.3 分步酶水解法

蛋白酶按作用位点可分为内切酶和外切酶。内切酶的种类主要有胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶；外切酶主要有菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、动物蛋白水解酶。内切酶从肽链内部将多肽水解成小片断，外切酶作用于肽链末端的肽键，逐个将氨基酸水解下来。在混合酶水解胶原蛋白基础上，应用复合酶分步水解，在酶解第一阶段先使用内切酶，使蛋白质颗粒水解成肽片段，第二阶段再使用肽链外切酶进一步水解，减小肽链的长度，降低水解液中的疏水氨基酸的比率，进一步提高水解度和改善风味[76,77]。分步复合酶水解胶原蛋白，能克服单一酶解反应中酶解程度受限，混合酶水解时可能会出现酶相互抑制的问题。分步酶解的缺点是工艺复杂，酶解效果还要根据相应指标如水解度、酶解物风味及抗氧化性等来确定。近年来报道的分步酶水解胶原蛋白工艺比较见表4。

表4 分步酶水解胶原蛋白工艺Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with proteinase step by step

由表4可知，在原料方面，分步酶解采用的畜禽副产物原料有畜禽皮和骨，水产副产物方面主要是骨和皮。分步酶解采用的酶多为双酶，其次是三酶水解，尚未见有4种或更多酶分步酶解的报道。在酶解效果方面，涉及的评价指标包括水解度、自由基清除率、钙离子螯合率及ACE抑制活性。比较表2和表3发现，分步酶解涉及的原料还比较少。因此，未来可在酶分步水解方面做更多探索。

4 胶原蛋白酶解过程存在的问题

尽管目前国内外已经对胶原蛋白的酶解工艺开展了较为广泛的研究，但是目前尚存在的问题：(1)酶解效率不高。因胶原蛋白的天然硬质结构，导致酶解效率低，产物的回收率不高的现象较普遍。以水解度为例，单酶水解度最高的尚达不到50%，但导致问题的机理尚不清楚。(2)原料的一致性有待改进。畜禽及水产品加工副产物的差异，导致酶解制备胶原肽的原料一致性难以保障。原料的一致性会引起后续实验的可重复性和实验结果的稳定性。(3)酶的种类与水解效果缺乏统一。从本文中的酶解胶原文献可以发现，酶解时使用的原料较广泛，采用的酶种类也较多，尚缺乏酶的种类和原料酶解效果的统一，这直接导致工业化应用时缺乏依据。

5 结论

我国是畜禽和水产品生产大国，每年产生的畜禽及水产品副产物量大，如何将这些副产物高附加值利用，减少资源浪费和环境污染，是直接影响我国畜禽及水产品产业发展的关键制约因素。目前国内外已经在畜禽及水产品副产物利用万面开展了一些探索。随着我国的环境保护要求越来越高，节能、绿色、环保的新技术在畜禽及水产品加工副产物回收利用中的应用将越来越受到重视。本文对近年来有关低污染、高效、节能的生物酶解技术在畜禽及水产品副产物利用的研究进展进行了对比分析，通过分析发现，在胶原酶解工艺方面，主要以单酶水解工艺居多，其次是多酶水解技术。在原料方面，涉及更多的骨、鳞及皮。在产物评价方法方面，更多的是采用水解度、自由基抑制率及肽的提取率、ACE抑制活性。在今后的研究中，期待在酶解效率提高及其机理探索、胶原肽的功能性评价、原料一致性及酶的种类差异与酶解效果评价关系方面有更多探索。

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