响应面法优化美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取工艺

郭磊，肖志晖，李鹏，阚欢，刘云

(西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，昆明 650224)

美味牛肝菌(Boletusedulis)，别名白牛肝菌、大脚菇，属真菌界(Fungi)，真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，牛肝菌科(Boletaceae)，牛肝菌属(Boletus)[1]。美味牛肝菌含有蛋白质、脂肪、黄酮类化合物、三萜类化合物、多糖等多种营养成分[2-6]，而提取物具有抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等药理活性[7]。在北美洲、欧洲北至斯堪的纳维亚半岛，南到希腊、意

大利的大部分地方、拉丁美洲的墨西哥以及整个亚洲均有分布[8]，中国是美味牛肝菌的主要分布区域，在云南有广泛分布[9]。

食用菌的挥发性香气成分主要包括挥发性八碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯类等，其中挥发性八碳化合物是食用菌最重要的风味物质[10]。香味物质在食品中含量很低，一般在ppb水平[11]。常用的食品风味物质的提取方法有溶剂萃取法、常规水蒸气蒸馏法、超临界萃取法、顶空收集法、同步蒸馏萃取法及固相微萃取法[12]。同时蒸馏萃取法(SDE)是一种提取、分离和富集试样中挥发性、半挥发性成分的有效方法[13]，广泛应用于食品分析、香精香料、药物化学等行业的样品分析前处理中[14]。常用的有机溶剂有正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙醋、正戊烷等。

近年来，随着生活水平和消费需求的不断提高，人们已经不再满足于大众化的调味品，更加偏好于风味独特的调味料，这对调味品行业的发展提出了更高的要求，美味牛肝菌风味独特，营养价值高，可开发出满足广大消费者需求的新型天然调味料。目前对美味牛肝菌及其加工制品的风味组成及变化的研究鲜见报道。

本研究通过同时蒸馏萃取法对美味牛肝菌干制品进行挥发性风味物质的提取，并通过Box-Benhnken响应面分析法优化风味物质的萃取条件，为研究云南美味牛肝菌的风味成分并进一步为研发天然牛肝菌调味品提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 美国 Agilent 科技有限公司；同时蒸馏萃取装置(定制)；RE-52A 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理与同时蒸馏萃取

云南美味牛肝菌在35 ℃下烘6 h，超微粉碎后过50目筛备用。

准确称取一定量的菌粉，放入SDE装置的1000 mL圆底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水和氯化钠并混合均匀，加热至沸腾。装置另一端的圆底烧瓶盛放一定量的正己烷溶液，放于水浴锅中，两端同时加热进行蒸馏萃取。一定时间后，降至室温置于旋转蒸发仪进行浓缩除去正己烷，称重计算提取量。

1.2.2 单因素实验

以正己烷为萃取溶剂，以挥发性风味物质萃取量为实验指标，研究萃取时间(h)、萃取温度(℃)、溶剂加入量(mL)、料液比(g/mL)等因素对云南美味牛肝菌挥发性风味物质萃取量的影响。因素水平如下：固定萃取温度75 ℃，溶剂加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL，下同)，考察不同的萃取时间(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)对萃取量的影响；固定萃取时间1h，溶剂加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL)，考察不同的萃取温度(60，65，70，75，80 ℃)对萃取量的影响；固定萃取时间1 h，萃取温度75 ℃，考察不同的溶剂加入量(30，40，50，60，70 mL)对萃取量的影响；固定萃取时间1 h，萃取温度75 ℃，溶剂加入量50 mL，考察不同的料液比(1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)对萃取量的影响。

从现场变形迹象来看：后缘以连续拉张裂缝、错落坎等变形迹象为主，局部出现坍滑现象，该工程边坡后缘风化岩体剥离，主要受优势节理裂隙影响，目前整体边坡无大变形迹象。

1.2.3 Box-Benhnken中心组合试验设计

在单因素实验结果的基础上，选择影响萃取量较大的3个因素如萃取时间(h)、溶剂加入量(mL)、料液比(g/mL)为研究对象，根据Box-Benhnken中心组合试验设计的原理，采用三因素三水平响应曲面分析方法，以萃取量为响应值，试验因素与水平的设计见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.2.4 数据处理

采用F检验对获得的数据进行方差分析并评价模型的统计意义，数据分析软件采用Design Expert 6.0.5。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 时间对萃取量的影响

图1 时间对萃取量的影响Fig.1 Effect of time on the extraction content

由图1可知，美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取量随着时间的延长先增加后减少，在萃取时间为1 h时达到最大，随后逐渐减少。随着萃取时间的增加，风味物质被萃取得比较完全，但当时间延长，由于本身的挥发造成损失的作用越来越大，含量逐渐减少。因此，最适萃取时间为1 h。

2.1.2 温度对萃取量的影响

图2 温度对萃取量的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction content

由图2 可知，随着温度的升高，美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取量先增加后趋于平衡，在温度为75 ℃时达到最大。随着温度的升高，正己烷由于达到自身沸点能够较好地萃取出挥发性风味物质，但温度的持续升高，正己烷蒸发过快造成萃取量稍稍减少，甚至部分物质性质不稳定而发生化学变化。因此，最适萃取温度为75 ℃。

2.1.3 溶剂加入量对萃取量的影响

图3 溶剂加入量对萃取量的影响Fig.3 Effect of solvent volume on the extraction content

由图3可知，随着溶剂加入量的不断增加，美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取量先增加后减少，当溶剂加入量为50 mL时达到最大。溶剂加入量增大会萃取更多的挥发性风味物质，但溶剂加入量过多，后期的旋转蒸发时间也较长，可能带出较多的风味物质，不利于收集。因此，最适溶剂加入量为50 mL。

2.1.4 料液比对萃取量的影响

图4 料液比对萃取量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content

由图4可知，随着固液比的增加，美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取量先增加后减少，在固液比为1∶40时达到最大。固液比的增加会增大样品间的疏散性，使得萃取量有较大增加，但固液比超过一定的值后，挥发性风味物质可能一部分溶在热水里而造成萃取量下降。因此，最适固液比为1∶40。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验方案及结果

在单因素结果的基础上，由 Design-Expert 6.0.5设计出的实验方案及结果见表2，以挥发性风味物质的萃取量为响应值，以影响萃取量较大的3个因素萃取时间(A)、 溶剂加入量(B)、 料液比(C)为自变量，建立三因素三水平的中心组合实验设计，实验结果，见表2。

表2 Box-Benhnken实验设计及其实验结果Table 2 Box-Benhnken test design and results

续 表

2.2.2 回归方程拟合及方差分析

采用Design-Expert 6.0.5对所得的实验数据进行回归分析，结果见表3，对各因素进行回归拟合后得回归方程：

Y=-20.37+5.61A+0.03B+1.03C-1.66A2-0.0014B2-0.01C2+0.0023AB-0.02AC+0.0029BC。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：**，P<0.01为极显著；*，P<0.05为显著。

回归模型的R2=0.7531，RAdj2=0.9487，可知回归方程模型极显著(p<0.0001)，该模型与实际拟合良好，实验方法可靠，失拟项不显著(p>0.05)，所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，可用此回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。结果表明C，A2，B2，C2，BC对响应值影响显著。

2.2.3 响应面图分析

对二次多项回归方程所做的相应曲面图见图5。通过三组动态图可对任何两因素交互影响萃取效应进行分析与评价，并确定最佳因素范围。

图5 两因素的交互作用对多糖得率的响应面图Fig.5 The interaction of the two factors on the response surface of polysaccharide yield

图5分别显示了萃取时间、溶剂加入量、料液比为零水平时，萃取时间(h)和溶剂加入量(mL)、萃取时间(h)和料液比(g/mL)、溶剂加入量(mL)与料液比(g/mL)对美味牛肝菌挥发性风味物质萃取量的交互影响效应。3个图中萃取量都随任意2个变量的增加呈上升趋势，达到某一定值时，曲面稍下降或趋于平缓。

2.2.4 验证实验

对回归方程进行求解，即萃取量最大值时的萃取条件为萃取时间1.46 h、溶剂加入量56.48 mL、料液比1∶42.28(g/mL)，最大萃取量达到6.27 mg/g，为方便实际操作将实验条件定为萃取时间1.5 h、溶剂加入量55 mL、料液比1∶40。取3等份美味牛肝菌粉进行平行实验，所得平均萃取量为5.98 mg/g，经回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明此响应面法可以有效优化美味牛肝菌挥发性风味成分的萃取工艺。

3 结论

目前，市场上的食用菌类调味品逐渐增多，但大多为干制油炸等粗加工产品，生产工艺简单，生产的调味料中食用菌的鲜香味营养成分物质未被充分释放出来[15]。美味牛肝菌具有独特的鲜香气味，将其做成风味独特、香味浓郁的天然调味品或者天然复合风味调料必定有着广阔的市场前景。

美味牛肝菌是具有云南特色的优势资源，本文采用同时蒸馏萃取法对美味牛肝菌的挥发性风味物质进行萃取，建立了美味牛肝菌挥发性风味物质的萃取回归模型，并优化出挥发性风味物质的萃取工艺条件。为分析美味牛肝菌挥发性风味成分的释放规律及进一步开发出美味牛肝菌复合调味料提供了一定的技术条件，具有一定的实用价值。

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