PLK1小分子抑制剂的抗肿瘤活性及其在肿瘤治疗中的应用现状

张德勇

真核生物中可逆性蛋白磷酸化受蛋白激酶调控，作为分子调控中最基本的机制，包括肿瘤在内的一系列病理的发生均因激酶依赖性调节通路异常而紊乱，故在肿瘤治疗中蛋白激酶被认为是重要的干预靶点之一[1-2]。文献研究显示约有500多种细胞内蛋白激酶被发现，有一半以上的蛋白激酶已有针对性的小分子抑制剂被研发出来，且FDA已经批准其中的35种进入临床应用，同时有超过500种目前正在接受临床试验[3]。作为高度保守的苏氨酸、丝氨酸蛋白激酶，Polo样激酶（polo-1ike kinase，PLK）在真核生物中广泛存在,之所以以果蝇同系物Polo对PLKs进行命名，主要是因为其首次在有丝分裂异常的果蝇突变体中被提出。随着研究的逐渐深入，PLKs家族于哺乳类动物体内共有5种亚型被发现，分别是PLK1～5，其主要在细胞有丝分裂周期及生长中发挥不可或缺的调控作用[4]（表1）。PLKs家族均表现为高度保守的功能与结构，除PLK5外，其他亚型在N-端均有一个苏氨酸、丝氨酸激酶结构域（kinase domain，KD)[5]。同时位于C-端特征性结构域 (poloboxdomain，PBD)，主要调节亚细胞动态定位及PLK激酶活性，除PLK4的PBD域仅有一个外，其他均含有2个[6]。磷酸肽可与PBD端序列进行结合，从而对激酶域进行直接作用以发挥调控PLK功能，包括亚细胞定位、底物结合及上游激酶的活化等[7]。故在细胞增殖和转运过程中PBD均发挥着重要作用,同该区域结合发挥抑制PLK1活性的抑制剂为底物竞争性抑制剂。PLK1于多数肿瘤组织中表达均显著上调，且参与细胞恶性生物学行为及肿瘤发生、发展，所有的证据均显示PLK1在肿瘤的治疗过程中可能是重要的干预靶点[8]。随着临床上对PLK1小分子抑制剂研究的深入，不断有新的PLK1高效选择性抑制剂被发现，以PLK1为靶点的肿瘤干预方案已成为肿瘤治疗中的热点。本文将对PLK1小分子抑制剂在肿瘤治疗中的应用现状及抗肿瘤活性进行综述。

表1 P L K s部分功能及定位

1 肿瘤与P L K 1的联系

在人类各部位肿瘤细胞中PLK1的表达均表现为异常升高，但在正常组织中呈低表达，故在肿瘤的诊断及预后中PLK1是重要的标志分子[9]。人类肿瘤中p53抑癌基因是截至目前发现的与肿瘤密切相关且可防止细胞向癌细胞转化的基因，可保证细胞遗传稳定性及正常凋亡[10]。p53蛋白在细胞染色体DNA损伤后可结合DNA相应部位，从而激活DNA自我修复，并使细胞周期于G1期停滞，细胞周期于DNA修复结束继续进行，同时p53蛋白于损伤修复失败后可启动凋亡程序诱导细胞凋亡，以防止细胞出现恶变[11]。而p53在肿瘤细胞中由于PLK1的异常升高而导致磷酸化，其活性也被抑制，导致p53凋亡程序在癌变细胞无法正常启动，使癌变的出现概率得到了极大提高。文献报道显示临床预后与PLK1的水平呈正相关，肿瘤的转移及肿瘤细胞的增殖在PLK1下调后得到抑制，而且正常细胞即使低表达PLK1也可存活[12]。目前PLK1小分子抑制剂的研究已在临床上广泛开展，其主要包括ATP竞争型或非ATP竞争型抑制剂，已有部分PLK1抑制剂已进入一期或二期临床试验。

2 P L K 1小分子抑制剂活性及应用现状

2.1 二氢蝶啶酮类 德国Boehringer Ingelheimg公司研制的BI2536和BI6727是ATP竞争型抑制剂，作为高选择性抑制剂，其较其他蛋白激酶（63种）选择性高出千倍以上，细胞有丝分裂中心体生成时BI2536可阻断其周期正常运转，引发细胞凋亡[13]。作为首个开始临床研究的PLK1激酶抑制剂，BI2536对胰腺癌、小细胞肺癌等具有较好的抗肿瘤效果，目前其已完成临床Ⅱ期实验。BI6727也是ATP竞争型二氢蝶啶酮类激酶抑制剂，其PLK1的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值达到 0.87nM，对 PLK2 及 PLK3 在高浓度时也具有一定的抑制效果，PLK1的IC50值为5nM和56nM。经过体内研究表明，BI6727与BI2536相比具有体内分布广、半衰期及释药时间长等优点。

2.2 嘧啶并二氮卓酮类化合物 TAK-960由瑞士罗氏公司研发，经体外实验证实其对乳腺癌、皮肤癌及乳腺癌等肿瘤细胞株均有明显的抑制作用，对PLK1的IC50值为2nM左右，耐药的优势显著[14]。其作为可口服的高选择性及高酶抑制活性的临床前候选药物，已开始进行临床Ⅰ期研究。二氢蝶啶酮类化合物与TAK-960的关键构效关系类似，酮羰基酰胺的NH与氧分别与Leu 59及Asp 194氨基酸残基相互影响，铰链区同嘧啶环可产生重要的氢键作用，TAK-960的重要基团为甲基和环戊烷，其细胞毒及PLK1的抑制活性在引入双氟取代后可显著改善。

2.3 喹唑啉并吡唑类化合物 作为可口服的选择性PLK1抑制剂，NMS-P937是由意大利Nerviano Medical Science公司研制，可对各类肿瘤细胞系及实体瘤表现出良好的抗增殖活性，其对PLK1的IC50值约2nM，同时对PLK2、3的选择性接近5000倍，是一类有效的选择性抑制剂，其目前正接受临床Ⅰ期实验。目前已解析出其共晶复合图（2YAC），PLK1铰链区的Cys 133残基与本化合物的氨基喹唑啉形成的氢键为活性必须，三氟甲氧基可提高化合物的选择性，N-甲基哌嗪基则可提高水溶性，重要的可提高活性的氢键由酰胺部分与水媒介作用形成，目前其已开始临床研究。

2.4 苄苯乙烯砜类化合物 作为苄苯乙烯砜类的重要代表，化合物ON01910是通过对α，β-不饱合砜类化合物进行筛选及结构优化而得到，其本质上是一类PLK1小分子非ATP竞争型抑制剂，其PLK1的IC50为9.10nM，并可结合酶的底物结合位点。其主要影响生物体细胞周期G/M期，而对激酶的抑制主要是通过与酶底物直接结合而发挥作用，使肿瘤细胞有丝分裂中纺锤体的生成被抑制，导致细胞周期停止，最终引发肿瘤细胞凋亡。此外肉瘤基因（sarcoma gene，Src）、PLK2、周期蛋白依赖性激酶-1（cyclin-dependent kinases1，CDK1）和Fyn的活性也可被ON01910抑制。研究通过临床Ⅰ期实验、动物实验及体外实验均表明ON01910同其他抗肿瘤药物联合用药时可发挥较好的协同效果，ON01910对于肿瘤的作用效果目前已处于Ⅲ期临床试验阶段，但ON01910的结合模式由于其结合位点比较特殊而仍不明确[15]。ON01910的底物结合区不易出现突变已被临床研究证实，故可推测其结合模式应该是可以预测的，且其对肿瘤细胞出现耐药性的可能性较低。

2.5 噻吩类化合物 GSK46136作为ATP竞争型的PLK1选择性抑制剂，是英国葛兰素史克公司研制的噻吩类化合物，其PLK1的IC50值达到2nM。GSK461364对细胞分裂的作用随着其浓度的变化而改变，在浓度＞300nM时，可使细胞周期G2期延迟；若浓度≤300nM时，可使细胞分裂停止于有丝分裂M期。目前GSK461364已经开始临床Ⅱ期研究。

2.6 N杂均二苯乙烯类化合物 HMN-214是HMN-176的前药，作为N杂均二苯乙烯类化合物的重要一员，HMN-214通过在HMN-176中加入乙酰基从而使HMN-176的吸收性能得到显著改善，HMN-214进入体内后可立即转化为HMN-176。HMN-176可抗多种癌细胞株，如DU-145、PC-3等细胞株的IC50值可在100nM左右。其通过影响PLK1在细胞内定位及分布，导致有丝分裂停滞于G2/M期，使纺锤体极体遭到破坏从而促进肿瘤细胞凋亡，但HMN-214对PLK1并无直接的抑制作用，且该类化合物作用机制还需进一步探索。目前其已开始临床Ⅱ期研究。

2.7 Ⅱ型抑制剂 文献报道显示激酶的ATP口袋中活化环的打开或关闭与激酶是否被活化密切相关，ATP口袋在激酶非活化状态时可形成一个新的疏水口袋，Ⅱ型抑制剂即为此时与该结合位点结合的[16]。化合物SBE-13由同源建模构建的PLK1的非活性构象筛选得到，对PLK1的IC50值为0.2nM，其对家族内部的PLK2与PLK3均具有较高选择性。SBE-13能够降低Hela细胞等各种癌细胞株细胞增殖，并引发细胞凋亡，但该类此化合物仍无明确的结合模式。

2.8 小分子天然产物的筛选和结构改造 目前先导化合物的探索主要通过高通量筛选法，而采用此法的全球范围内多个研究团队对靶向作用于PBD的小分子天然产物的研究取得了一系列可喜的成果，同时深入探索了该类化合物的相关作用机制[17]。

提取自埃及黑种草中的天然产物百里醌（图1a）不仅具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化等作用，还有抗肿瘤等效果，其各类功效均已被大量文献报道所证实[18]。百里醌可有效抑制多类肿瘤细胞系的生长，对肿瘤细胞有较好的特异性，可其对肿瘤细胞干预的相关机制及分子靶点仍需要进一步的探索，但已经有文献研究表明其干预靶点可能为PLK1的PBD。现阶段相关研究显示PBD与该磷酸化基团结合可被百里醌阻断，使PLK1的亚细胞无法正常定位，进而阻滞细胞周期于G2/M期，最终引发肿瘤细胞凋亡[19]。其对PDB的IC50约为1μmmol/L，但百里醌对PLK1的选择性不佳。Poloxin（图1b）的关键结构与百里醌类似，其主要通过用高通量筛选方案和荧光偏振技术筛选出的可结合PBD的小分子化合物。Poloxin与PBD发生结合，以使PLK1同底物间互相影响，最终发挥抑制PLK1的作用，其对PDB的IC50约为4.8μmmol/L，对PLK1的选择性Poloxin显著优于百里醌。两者均可与PBD结合从而导致染色体聚集异常和PLK1错误定位，最终使肿瘤细胞因有丝分裂受阻而凋亡。Poloxin对中心体的严重影响是其抑制肿瘤细胞的重要特征。宋云龙课题组的研究成果显示Poloxin和百里醌均能结合PBD中底物的磷酸基结合位点，且两者同磷酸基的结合位点氨基酸残基是经过π-cation来发挥相互作用[20]。

以苯并托酚酮为母核的红倍酚（图1c）提取自没食子。国外研究通过高通量筛选对其化合物库进行筛选，结果显示PLK1的PBD对底物的识别可被红倍酚抑制，其还可使HeLa细胞的有丝分裂周期延长，使有丝分裂的起始延迟[21]。红倍酚的IC50在0.3μmmol/L左右。有研究显示马兜铃内酰胺的衍生物Aristolactam AⅢa（图1d）可对血小板聚集起到抑制效果，研究通过在HeLa细胞中显微注射10μmmol/L的Aristolactam AⅢa，结果显示细胞周期在G2/M期停滞，且全部细胞均在24h后与其发生结合，接着观察HeLa细胞后发现与PLK1小分子抑制剂作用于细胞的效应类似，大部分的细胞表现为无法重合的染色体和多极纺锤体[22]。Aristolactam AⅢa对多种肿瘤细胞系的抑制效果较好，IC50达到7～30μmmol/L，其对腺癌的抑制活性甚至超过长春瑞滨。同时Aristolactam AⅢa的其他衍生物均可抑制恶性上皮肿瘤及淋巴瘤等细胞，但其作用机制仍需进一步探索。

2.9 含有磷酸化的丝氨酸/苏氨酸的短肽及其衍生物目前多肽及多肽衍生物对PLK1的PBD作用的研究已经取得了一定的成果。Yun等[23]的研究通过截取PLK1底物蛋白PBIP1中的磷酸肽，并截断多肽的C端及N端，结果显示磷酸化的五肽PLHSpT（图1e）是最短的可与PLK1的PBD结构域较好结合的多肽序列。蛋白结合能力可受到该类化合物多肽骨架及磷酸基的显著影响，PLK1结合的选择性则与其N端亮氨酸、脯氨酸残基密切相关。通过对PLHSpT晶体结构进行研究后显示，PLK1中的Lys540及His538的残基可与磷酸基形成盐桥，且PLK1中的多个肽键可与多肽骨架有氢键效应。PLK1的Arg516胍基可与PLHSpT中脯氨酸羰基形成氢键，Arg516、Phe535于PLK1中组成的疏水性口袋可与脯氨酸中疏水性五元环结合。氨基酸Lys和Tyr在PLK2和PLK3中类似于PLK1中的Arg516和Phe535，严重影响脯氨酸的正常结合。故对PLK1 PLHSpT的选择性较高。当PLHSpT中组氨酸被丙氨酸取代后蛋白结合能力可受到明显影响，即使研究显示PLK1与组氨酸并无明确的相互作用。通过分析其晶体结构可知，PLHSpT蛋白结合能力与其构象密切相关，而丝氨酸中羰基可与组氨酸中咪唑环上NH形成分子内氢键，PLHSpT构象可受氢键有效控制。于脯氨酸的五元环或组氨酸的咪唑环上引入疏水性基团或碳链可使PLK1与多肽的结合能力显著提高。经过对该类环状肽的探索可为进一步设计新型以PBD为靶点的小分子PLK1抑制剂提供重要的线索。

3 结语

肿瘤对人类的生命健康有着重要的影响，随着环境及生活方式等发生重要变化，其发病率表现出逐年上升的趋势，随着临床对PLK1研究的深入，以其为靶点对肿瘤进行有效干预已成为热点研究方向，而大部分的证据均显示PLK1小分子抑制剂在抗肿瘤方面极具应用前景。但该类药物目前主要还停留在临床试验阶段，且该类化合物的内部选择性仍需进一步提高，而靶向药物不良反应与选择性不佳密切相关，严重的不良反应常常会给肿瘤患者带来额外的伤害。同时PLK1小分子抑制剂在多数临床实验中给药途径通常是静脉注射，使用存在极大的不便，故寻找具有可口服等良好理化性质，对PLK1具有特异性及高效性的小分子抑制剂并使其安全有效地应用于临床是我们需要重点关注的问题。

图1 作用于P B D的小分子天然产物

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