支气管哮喘小鼠细胞免疫因子及Th17细胞水平的变化及发病机制研究

徐静 金晓洁 缪志海 夏斌 戴元荣

支气管哮喘是呼吸系统常见的疾病，近年来，发病率呈明显上升趋势[1]。支气管哮喘是由多种细胞以及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，虽然其发病机制目前尚不完全清楚，但研究表明，与环境因素、遗传背景和免疫调节紊乱等诸多因素有关[2]。目前，临床上对于支气管哮喘的治疗主要选用吸入性糖皮质激素和β2受体激动剂，但长期应用会使患者出现骨质疏松、免疫功能下降等不良反应[3]。因此，探讨支气管哮喘的发病机制对于提高临床治疗的有效性，降低患者不良反应的发生均具有十分重要的指导意义。已有研究显示，在支气管哮喘的发病过程中，细胞免疫因子起到了调控、延续以及级联放大炎性反应的重要作用[4]。同时，已有研究表明，在支气管哮喘动物模型中，气道适应性的产生、调节均与T细胞的产生密切相关[5]。因此，本研究对支气管哮喘小鼠细胞免疫因子（IL-4、IL-5和IFN-γ）及辅助性T细胞（Th）17细胞水平（IL-10和IL-17）的变化及发病机制进行探讨，旨在为支气管哮喘的临床治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选择SPF级昆明种小鼠24只，雄性，6～8周，体质量（20±2）kg。采用随机数字表法分为哮喘模型组和正常对照组各12只。哮喘模型组小鼠平均体质量（20.86±0.79）kg，正常对照组小鼠平均体质量（20.59±0.86）kg，两组小鼠平均体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要试剂 卵清蛋白（OVA）购自美国Sigma公司，规格：100mg，批号：Sigma-A5503。IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司。

1.3 主要仪器和设备 美国Wescor离心涂片机（型号：CYTOPRO7620）购自北京艾泽信科技公司；奥林巴斯显微镜（型号：BX43）购自上海赖氏电子有限公司；博科超低温冰箱（型号：BDF-25V270F）、博科垂直流净化工作台（型号：BBS-SDS）购自山东济南鑫泽铭医疗器械有限公司；台式高速离心机（型号：TG16-WS/TG16WS）购自长沙市湘仪离心机仪器有限公司；精密恒温水浴锅（JHH4A）购自上海冠森生物科技有限公司；超灵活滤片式FilterMax F3多功能酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司；25、50、100、200μl赛默飞世尔单道可调移液枪购自山东济南来宝医疗器械有限公司。

1.4 小鼠哮喘模型的建立[6]哮喘模型组小鼠分别于实验开始当天和第8天腹腔内注入OVA混悬液[含OVA/Al（OH）310mg/g]50μg/次致敏，并于第16天给予雾化吸入含1%OVA的0.9%氯化钠溶液30～40ml进行激发，持续30～40min，1次/d，连续7d。正常对照组小鼠则给予等量的0.9%氯化钠溶液。

1.5 支气管肺泡灌洗液（BALF）和外周血血清的收集及制备 两组小鼠均在最后一次激发后24h，眼球取血处死，固定，打开胸腔行气管插管，对左侧主支气管进行结扎，采用磷酸盐缓冲液（PBS）行支气管肺泡灌洗3次，3～4ml/次，回收率均为80%以上。收集BALF，室温1200r/min 离心 5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存，备用。外周血通过眼球取血获得，室温1200r/min离心5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存。

1.6 BALF中炎性细胞计数 将收集到的BALF采用离心涂片机进行细胞收集，HE染色后，在显微镜下进行炎性细胞总数和分类计数。

1.7 细胞免疫因子及Th17细胞水平检测 采用ELISA法检测两组小鼠外周血及BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17水平。所有实验操作严格按照说明书进行。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠行为的比较 正常对照组小鼠行动自如，未见异常。哮喘模型组小鼠致敏后活动少，可见明显的扭体反应；激发过程中小鼠精神状态欠佳，以俯卧为主，并可见不同程度的头面部瘙痒，呼吸急促，鼻翼煽动，烦躁不安，腹肌抽搐以及大小便失禁等症状。

2.2 两组小鼠肺组织病理切片HE染色结果的比较正常对照组小鼠肺组织中气道内纤毛上皮排列整齐，黏膜皱壁未见水肿，结构清晰，支气管周围无炎性细胞浸润，仅可见极少量的杯状细胞，无明显黏液分泌，见图1a。哮喘模型组小鼠肺间质及肺泡腔内可见大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且支气管周围已被大量的炎性细胞浸润，气道上皮组织结构紊乱，其内可见大量杯状细胞增生，大量黏液分泌并形成黏液栓，相对阳性着色面积增大，见图1b。

图1 两组小鼠肺组织病理切片（a：正常对照组小鼠肺组织；b：哮喘模型组小鼠肺组织；H E染色，×200）

2.3 两组小鼠BALF中炎性细胞分类计数的比较 与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞分类计数均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组小鼠B A L F中炎性细胞分类计数比较

2.4 两组小鼠BALF和血清中细胞免疫因子表达水平的比较 与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠B A L F和血清中细胞免疫因子表达水平的比较

2.5 两组小鼠BALF和血清中Th17细胞水平的比较与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠BALF和血清中IL-10水平明显降低，而IL-17水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 两组小鼠B A L F和血清中T h17细胞水平的比较（n g/L）

3 讨论

3.1 细胞免疫因子在支气管哮喘发病中的作用 免疫细胞因子在机体的免疫过程中扮演着十分重要的角色。本研究结果表明，与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明显升高，差异均有统计学意义。仕丽等[7]探讨定喘止哮颗粒对支气管哮喘模型组大鼠血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影响，结果表明定喘止哮颗粒能够明显增加支气管哮喘模型组大鼠血清中IFN-γ水平，降低IL-4、IL-5水平，主要通过调节Th1/Th2细胞之间功能平衡，从而达到减轻气道炎性反应的作用。

3.2 Th17细胞在支气管哮喘发病中的作用 随着环境问题的日益恶化，我国支气管哮喘的发病率已呈逐年上升趋势，且严重影响了患儿的免疫功能，给治疗带来了极大的困难，给家属带来了极大的负担[8-9]。Th17细胞分泌的IL-17是较为强大的促炎细胞因子，其能够促进多种细胞释放炎性因子而致使炎症反应[10]。细胞因子IL-10则具有抗炎作用，能够有效抑制促炎细胞因子的合成[11]。本研究结果表明，与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠BALF和血清中IL-10水平明显降低，而IL-17水平明显升高，差异均有统计学意义。魏秀娟等[12]研究发现，与健康体检者相比，缓解期支气管哮喘患者和急性发作期支气管哮喘患者血清中IL-17水平明显升高，同时急性发作期患者血清中IL-17水平明显高于缓解期患者，从而表明血清中IL-17水平的高表达可能与支气管哮喘的形成有关，并对疾病的进程产生一定的影响。张艳丽等[13]采用ELISA法检测正常健康儿童、哮喘急性发作患儿、哮喘缓解患儿血清中IL-10水平，结果表明哮喘发作患儿较哮喘缓解患儿和正常健康儿童血清IL-10水平明显提高。

综上所述，支气管哮喘小鼠肺组织内可见大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且相对阳性着色面积增大，同时BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞分类计数均明显升高，可能与BALF和血清中IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-17水平明显升高，而IL-10水平明显降低密切相关。本研究还存在不足之处，如研究例数较少等，另外对支气管哮喘小鼠的免疫机制有待进一步的研究。

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