鸭瘟活疫苗滴鼻诱导的黏膜免疫效果评价

李爱欣，李颖异，蒋文灿，胡 欣，李 鑫，曾晓慧，白 瑜

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 温江611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都611130)

鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒(DPV)引起的鸭、鹅和其它雁形目禽类的一种急性、热性、败血性疾病[1]。DPV能够在鸭或其它水禽体内持续存在，并且定期向体外排毒而在鸭群中广泛传播，引起DP的流行，给我国养鸭业造成了较大经济损失[2]。目前国内外没有确实有效的治疗方式，主要通过肌肉、皮下注射DPV疫苗等方法来预防DP的发生和流行[3]。

黏膜免疫系统是机体整个免疫系统的重要组成部分。研究表明，使用合适剂量活疫苗经黏膜免疫能够有效预防鸡传染性支气管炎、鸡新城疫等家禽传染病[4-5]，且常见活疫苗黏膜接种途径中，滴鼻免疫综合效果较好[6-8]。但目前这些方法未见在DP预防中广泛应用。

IgA、IgM、IgG是机体抗感染过程中产生的3种主要抗体，其中IgA是黏膜免疫的主要效应分子，IgM是抗感染过程中最早出现的抗体，IgG是最主要的抗体[9-10]。综合检测这3种抗体水平可以全面、直观地评价免疫效果。基于此，本研究检测了DPV活疫苗滴鼻免疫与肌注免疫鸭的呼吸道、消化道不同组织器官黏膜IgA、IgG、IgM的含量，并结合攻毒试验来评价不同免疫方式诱导的黏膜免疫效果，为临床DP选择滴鼻免疫在鸭病防治上的实际应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 鸭必应-鸭瘟活疫苗，500羽份/瓶，购自哈药集团生物疫苗有限公司；DPV Chv强毒株由四川农业大学禽病防治研究中心分离鉴定；鸭IgA ELISA检测试剂盒(批号：20161206)、鸭IgG ELISA检测试剂盒(批号：20161206)、鸭IgM ELISA检测试剂盒(批号：20161206)，均购自深圳子科生物科技有限公司。1日龄奥白星肉鸭，购自成都克里莫育种有限公司。

1.2 雏鸭免疫试验84羽1日龄雏鸭，正常饲养至21日龄，随机分组后进行下述免疫试验(表1)。

表1 雏鸭免疫的实验设计Table 1 Design for antibody detection experiment

1.3 免疫鸭的抗体检测 于首免后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d分别随机选取对照组、一免滴鼻组、一免肌注组各3羽，采集其鼻腔拭子、气管、腺胃、十二指肠、直肠各2块组织样品。将组织样品分别放入装有1 mL PBS的EP管中剪碎，4℃放置24 h后1 000 r/min离心10 min、8 000 r/min离心6 min后取上清液，按ELISA试剂盒说明操作，检测鸭鼻腔及各组织器官中特异性抗体含量。二免滴鼻组、二免肌注组分别于首免后第14 d、21 d、28 d、35 d、42 d各随机选取3羽采样，采样及抗体检测方法同一免组。实验数据采用Excel 2016软件进行初步处理及整理，建立试剂盒标准品浓度与OD450nm值的方程并绘制标准曲线(R2为0.9678～0.983)，将测得的OD450nm值换算为抗体滴度，并使用GraphPad Prism 7.0软件统计绘制各组鸭消化道、呼吸道各组织器官IgA、IgG、IgM抗体滴度随时间变化的直方图。

1.4 攻毒试验设计 将30羽1日龄雏鸭按如下分组：一免滴鼻组、肌注组，各6羽，于21日龄时滴鼻/肌注接种1羽份鸭瘟活疫苗；二免滴鼻组、肌注组，各6羽，于21日龄、28日龄各滴鼻或肌注接种1羽份鸭瘟活疫苗；对照组6羽，不接种疫苗。56日龄(即免疫后35 d)时所有鸭均肌注100 LD50鸭瘟Chv株强毒液，观察18 d，每天记录鸭发病死亡情况。

2 结果

2.1 各组鸭抗体检测结果 将84羽21日龄雏鸭随机分5组，分别为一免滴鼻组(NAⅠ)与一免肌注组(IMⅠ)(仅免疫一次鸭瘟活疫苗)、二免滴鼻组(NAⅡ)与二免肌注组(NAⅡ)(首免后7 d加强免疫一次鸭瘟活疫苗)、对照组。首免后，每隔7 d随机选取各组各3羽鸭，采用ELISA法检测其呼吸道与消化道各组织器官黏膜中DPV特异性IgA抗体水平。结果显示，除对照组外，各组雏鸭免疫后7 d均可检出IgA，免疫后42 d该抗体水平仍显著高于对照组(p＜0.01)。除十二指肠外，滴鼻组鸭该抗体均于免疫后21 d达到最高水平，较肌注组早7 d达到峰值。滴鼻组鸭鼻、气管、十二指肠中该抗体峰值均略高于肌注组(p＞0.05)，二免滴鼻组鸭胃、直肠中该抗体峰值均高于肌注组(p＜0.05)(图1)。表明，滴鼻接种能够较早诱导机体产生黏膜免疫，并且达到相对高的IgA抗体水平。

图1 各组鸭不同组织器官特异性Ig A抗体检测结果Fig.1 The dynamics of DPV specific IgA titers in the ducklings from different groups

除对照组外，各组鸭各组织器官于免疫后7 d即可检出IgG，且于免疫后14 d达到峰值，免疫后42 d仍能检出该抗体。滴鼻组气管、胃、十二指肠3个器官均较肌注组IgG抗体水平高(p＜0.05)。二免肌注组鸭鼻、胃、直肠中该抗体峰值高于滴鼻组(p＜0.05)，其余2个组织器官(十二指肠、气管)该抗体水平两组基本持平(p＞0.05)。结果表明滴鼻与肌注刺激黏膜产生的IgG抗体水平相差不大，这与IgG为血源性抗体，在黏膜中含量不高有关。

各组鸭各组织器官于免疫后7 d即可检出IgM抗体且达到峰值，随后迅速降低。除十二指肠一免后两组该抗体水平持平外(p＞0.05)，其它组织器官该抗体水平滴鼻组均显著低于肌注组(p＜0.01)。二免滴鼻组鸭的胃、直肠该抗体峰值显著高于肌注组(p＜0.01)，仅气管该抗体水平显著低于肌注组(p＜0.01)。表明一免后滴鼻和肌注对IgM抗体水平影响不大，但二免滴鼻组粘膜免疫效果略优于肌注组。

综合图1、2、3，滴鼻组与肌注组经活疫苗免疫后鸭黏膜中各种DPV特异性抗体水平较对照组均有明显升高(p＜0.01)。这3种抗体在机体相同器官的产生发展规律与齐雪峰的研究结果基本一致[11]：两种免疫途径免疫鸭各器官黏膜抗体水平中IgM峰值出现时间最早，且滴度下降较快；IgA抗体水平于各器官黏膜中最高，且存留时间较长，免疫后42 d仍然能检测到高滴度IgA；通过对两种途径免疫鸭黏膜中各抗体滴度的比较显示：滴鼻免疫DPV活疫苗鸭黏膜中的IgA抗体滴度高于肌注免疫，但两种免疫方式对IgG和IgM抗体水平影响不显著。

图2 各组鸭不同组织器官特异性IgG抗体检测结果Fig.2 The dynamics of DPV specific IgG titers in the ducklings from different groups

图3 各组鸭不同组织器官特异性IgM抗体检测结果Fig.3 The dynamics of DPV specific IgM titers in the ducklings from different groups

表2 免疫鸭的攻毒保护试验结果Table 2 Protection of immunized ducklings against DPV challenging

2.2 免疫鸭的攻毒试验结果 采用相同的方式免疫鸭后以100倍LD50剂量的鸭瘟Chv株强毒攻击。结果显示，经过一次加强免疫后，滴鼻组鸭的攻毒保护率从83.33 %上升至100 %；肌注组保护率均为100 %。这表明低免疫剂量滴鼻有一定的免疫不确实的风险。本实验中肌注组达到100 %保护率，但也不能忽略实际生产中肌注应激性较大的缺点。

3 讨论

临床证实，使用DPV活疫苗预防鸭瘟能起到较好的效果，但以往对免疫效果的评价常局限于血清中特异性IgG这一个指标。95 %以上病原体的入侵发生在人或动物的黏膜组织，黏膜组织中的黏膜免疫系统(Mucosal immune system，MIS)是机体免疫系统的重要组成部分，是机体抗感染的第一道免疫屏障，对预防通过黏膜入侵机体的病原体引起的疾病具有重要意义，黏膜中特异性IgA水平是反映黏膜免疫效果的重要指标[12-14]。本实验结果显示鸭消化道及呼吸道黏膜中抗DPV特异性IgA、IgM、IgG的产生和变化规律各有其特点，并且与其在血清中产生的规律有一定的相似之处[15]，免疫后Ig M检出时间最早下降最快且含量最少，IgA、IgG含量较高且能维持一定时间。IgM在紧急预防和早期免疫中发挥重要作用，在采样的各器官均最先产生，为IgA和IgG进一步中和病原奠定基础[5,11]。而IgA于免疫两周后达到峰值且能维持较长时间，该类抗体作为黏膜免疫的主要效应分子，是黏膜中检出滴度最高的一类抗体，在血清中含量不高，符合其主要由黏膜淋巴细胞分泌的特性[14]。IgG与IgA相反，IgG为血源性抗体，在血清中含量更高，在黏膜中的含量要低一些，且有研究显示动物机体消化道黏膜固有层中可分泌IgG的B细胞数量较少，黏膜分泌液中的IgG主要来源于血清[5,11]。3种特异性抗体的产生与消失均遵循一个较为固定的规律，不易受免疫方式的影响。

本实验结果显示，DPV活疫苗经滴鼻和肌注两种不同途径免疫鸭，均可以诱导鸭呼吸道和消化道局部黏膜产生DPV特异性抗体，具有一定的保护力。肌注虽然不能像滴鼻那样直接激活黏膜免疫，但DPV活疫苗肌注免疫鸭粪便中的病毒进入环境，可以重新进入雏鸭体内，接触黏膜诱导免疫[16]。而通过滴鼻接种DPV活疫苗，可以使DPV弱毒同时接触鸭鼻、喉等呼吸道器官及其咽、食道等消化道，且在呼吸道黏膜致敏的淋巴细胞也可以传播到消化道等其它器官的黏膜组织，使消化道黏膜也能检测出较高滴度的IgA[17]。综合各项数据可知，使用DPV活疫苗通过滴鼻免疫可以激发较好的免疫效力，但也有其缺点。

由于目前尚无市售DPV专用滴鼻疫苗，本实验采用了市售常用的商品疫苗，这对滴鼻的实验结果可能产生一定影响。一次免疫时滴鼻组鸭IgM抗体在各器官的峰值均普遍低于肌注组鸭，表明低剂量的该DPV商品疫苗滴鼻诱导产生IgM的速度较肌注慢、水平低，早期保护力较弱，二次免疫后可以加强早期保护力，诱导较高且持续时间较长的抗体水平。

本实验结果显示滴鼻组的DPV特异性IgA抗体水平较肌注组提早7 d达到峰值，二次免疫后的5个采样器官中，有4个器官(鼻、气管、腺胃、直肠)抗体峰值均超过肌注组，仅1个器官该抗体峰值与肌注组持平。这表明滴鼻使DPV弱毒直接接触黏膜，相较肌注更快、更多地诱导了黏膜免疫的主要效应分子IgA的产生。滴鼻的优点在于激发免疫应答快，提高免疫剂量后产生的免疫效果较肌注更好[18]，且较肌注产生的应激性小，能够避免肌注所致防卫机能减弱、易引发感染引发疾病等情况发生[19]。在临床中进行滴鼻免疫时，会出现液体滑脱现象，参考鸡用滴鼻瓶进一步改进盛装疫苗液的容器，可能会弥补这一不足[18]，或者摸索合适的免疫剂量，进行二次免疫，均能够优化滴鼻免疫效果。

本研究结果表明，DPV活疫苗滴鼻免疫可以诱导鸭产生与肌注接近同等的保护力，并且其应激性相对较小，使用专用容器或二次免疫均能够优化滴鼻免疫的效果。为滴鼻免疫在鸭病防治上的实际应用提供参考和依据。