幼年暹罗鳄致病性简达气单胞菌的分离鉴定

蒲文渊，曾纪锋，郑 挺，欧秀全，杨 诺，郭桂英，王 宇，郑继平*

(1.海南大学 生物技术学院，海南 海口570228；2.海南大学 动物科技学院，海南 海口570228；3.陵水华天龙养殖有限公司，海南 陵水572435；4.海南省陵水县光坡镇人民政府，海南 陵水572400)

简达气单胞菌属于气单胞菌属，为运动性气单胞菌，与嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌等其它气单胞菌，作为养殖水体及水生动物体内正常存在的菌群[1]，通常不引起感染。若动物处于应激状态下，如动物的运输、抓捕、受伤以及水温变化等，致使细菌快速增殖，突破机体屏障，侵入体内引发疾病[2]。迄今为止，已报道简达气单胞菌作为病原引起的动物发病的病例有罗非鱼、欧洲鳗、虎头鲨、斑马贻贝以及人的糖尿病继发感染、伤口感染等[3]，但鳄鱼的简达气单胞菌感染发病尚未见报道。

2016年4月海南陵水地区某鳄鱼养殖场多只10月龄仔鳄鱼出现厌食、精神沉郁、四肢无力及腹下皮肤出血等症状，病理解剖，主要病变见肺部淤血，肝轻度肿大，淤血。从病死的仔鳄鱼体内分离获得一株致病性病原菌，采用细菌形态观察及生理生化特征测定等常规表型鉴定方法，并结合16S rRNA基因序列系统发育学的分析对其进行鉴定，确认其为简达气单胞菌。同时对该菌株进行致病性试验及抗菌药物敏感试验，为该病的诊断和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源及实验动物 病料样品采自海南陵水地区某鳄鱼养殖场死亡的10月龄的幼年暹罗鳄，主要病变见腹下皮肤有出血点，肺淤血及肝淤血、肿大，无菌采集心血、肝脏、脾、肺组织；实验动物NIH小鼠购自广东省医学实验动物中心，体质量为23±2 g。

1.2 主要试剂Mueller-Hinton琼脂培养基购自英国OXIOD公司；细菌生化微量鉴定管和抗菌药物纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、10×缓冲液、DL2000 DNA Marker、PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶，购自北京艾德莱生物科技有限公司；pXT19-T载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 细菌的分离 无菌采集死亡鳄鱼的心血、肝、肺病变组织分别接种于血琼脂平板，采用有氧及厌氧培养方法，28℃培养24 h～48 h，观察细菌的生长状况，挑取形态一致的优势菌落划线培养，获得纯培养菌株。同时，将病变脾、肝、肺脏器组织样品加入无菌生理盐水进行研磨，反复冻融后，3 000 r/min离心20 min，吸取上清液，经0.22μm细菌滤器过滤，滤液腹腔接种NIH小鼠，0.2 mL/只，连续观察7 d。

1.4 细菌形态及理化特性鉴定 取分离纯化后的菌株，命名为陵水5号(LS5)，划线接种于TSA琼脂培养平板和普通琼脂平板中，28℃培养24 h，观察细菌的生长情况和菌落形态，取细菌培养物进行革兰氏染色，显微镜观查其形态；将纯化的LS5菌株接种于细菌生化微量管中，按常规方法进行细菌生化特性的测定，具体试验方法参照《常见细菌系统鉴定手册》及细菌生化微量鉴定管操作说明书进行。

1.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析 按照DNA快速提取试剂盒所述方法，提取LS5菌株基因组DNA，以其为模板，采用细菌16S rRNA通用引物(F：5'-GGGATAACTACTGGAAACGGTA-3'/R：5'-GAAGGCACTCCCGTATCTCTA-3')进行PCR扩增，反应程序：94℃3 min；93℃30 s、54℃30 s、72℃90 s，30个循环；72℃10 min；PCR产物回收纯化后克隆至pXT19-T载体中，阳性的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

将分离菌16S rRNA测序结果与已知GenBank数据库中的核酸序列进行Blast比对，利用MEGA 6.0软件进行序列同源性分析，通过Neighbor-Joining方法，构建LS5系统进化树。

1.6 致病性试验 将菌株LS5接种于TSA琼脂斜面，28℃恒温培养16 h～20 h，灭菌生理盐水洗下菌苔，采用菌落计数法调整菌悬液浓度为5.4×108cfu/mL，再用生理盐水10倍梯度稀释为5.4×108cfu/mL～5.4×103cfu/mL，取不同稀释度菌液腹腔注射NIH小鼠，剂量为0.2 mL/只，每组10只小鼠，对照组为腹腔注射0.2 mL/只的生理盐水，连续观察7 d。采集死亡小鼠脾、肝、心血等组织对病原菌进行再次分离，对培养物进行革兰氏染色、形态检查及生理生化特性测定，采用改良寇氏法计算其半数致死量(LD50)[4]。

1.7 抗菌药物敏感试验 采用改良Kirby-Bauer法[5]对LS5株细菌进行抗菌药物敏感性试验，参照杭州天和微生物试剂有限公司《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》判定该菌对抗菌药物的敏感程度。

2 结果与讨论

2.1 病原菌的分离及形态特征 将死亡仔鳄鱼进行病理剖检，取肝、肺、心血组织病料样品在血琼脂平板划线培养，均长出形态单一，呈β溶血的菌落，各挑一个单一菌落经纯化后，划线接种TSA琼脂培养基上，形成圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、中央隆起、不透明、灰白色的菌落；革兰氏染色检查均为革兰阴性，菌体短小，多为单个排列，无芽胞、无荚膜杆菌，生理生化特性测定也均一致(图1)。因此，确认为同一细菌，把心血分离获得的菌株命名为LS5株。心血、肝、肺组织研磨液经0.22μm细菌滤器过滤后，将滤液接种NIH小鼠，观察期间未发现其发病及死亡现象。

图1 分离菌株革兰氏染色镜检(1000×)Fig.1 Microscopic examination of the isolate by Gram staining(1000×)

2.2 病原菌的生理生化测定 参照文献[3]的标准，生理生化测定结果显示，分离菌株LS5的生化特性与简达气单胞菌基本一致，可初步确定LS5为简达气单胞菌(Aeromonas jandaei)(表1)。

2.3 16S rRNA基因序列分析及系统发育树的构建分离菌株LS5的16S rRNA基因经PCR扩增后获得的片段约为1 500 bp，与预期大小一致。在NCBI中采用BLAST，对LS5菌株的16S rRNA基因序列进行分析，构建LS5进化树(图2)。菌株LS5在NCBI中与FJ940830.1Aeromonas jandaeipW23菌株同源性高达100 %，同时在系统发育树中与FJ940830.1Aeromonas jandaeipW23位于同一进化分支。因此，结合菌株的表型特征、生理生化特性鉴定与16S rRNA序列分析，可以判定菌株LS5为简达气单胞菌Aeromonas jandaei。

2.4 致病性试验 海南地区每年的3月至4月，昼夜温差大，仔鳄鱼养殖池水量少，水温波动较大，仔鳄鱼体温日夜温差变化大，易导致其感染患病。Roh报道了将鳄鱼养殖温度从16℃提高至26℃，由于环境温度的改变过大，导致了鳄鱼体温调节障碍，引发鳄鱼气单胞菌感染患病死亡病例[6]。本研究获得分离菌株LS5接种NIH小鼠多在24 h～72 h内死亡，显示对NIH小白鼠有较强的致病性，死亡小鼠可见肝脏和肺充血、出血，脾脏充血肿大，心包积多量液体，从死亡小鼠中进行病原再次分离培养，可分离获得形态和生理生化特征与LS5株特征一致的菌株。采用改良寇氏法计算LS5对NIH小白鼠的LD50为4.1×105cfu/只。表明简达气单胞菌分离株对小鼠的致病力强，能够引起小鼠感染死亡；而鳄鱼的组织滤液对小鼠致病试验，未发现发病及死亡，表明简达气单胞菌感染是引起幼年鳄鱼发病死亡的主要原因，环境温度的强烈变化是其发病的主要诱因。

表1 分离菌株LS5的生化试验结果Table 1 Main biochemical characteristics tested for the isolate LS5

图2 基于LS5 16S rRNA基因构建的LS5分离株的系统发育树Fig.2 The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence of isolate LS5

2.5 药敏试验 鳄鱼的细菌性疾病防治主要依靠抗菌药物，25种抗菌药物的药物敏感试验结果显示，简达气单胞菌分离株LS5对红霉素、链霉素、克林霉素等9种抗生素耐药；对新霉素、诺氟沙星等3种抗生素中度敏感；对庆大霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等13种抗生素敏感；其耐药谱与报道的罗非鱼简达气单胞菌NL05株有差异[7]，NL05株对第一代头孢霉素均耐药而LS5则显示敏感；从斑点叉尾鲖分离杀鲑气单胞菌ry01株[8]，虽然有种的差别，但其耐药性与LS5差别却较小，这或许与养殖过程中抗生素的使用状况及养殖环境有较大的关系。药敏试验的结果可为鳄鱼细菌性疾病防治提供一定依据，但由于鳄鱼饲喂的特点，药物的定时定量投给较为困难，抗菌药物的治疗效果并不理想，因此加强仔鳄鱼饲养管理，依据实际情况对养殖池水温适当调控，并对池水进行适当的换水及消毒，预防为主，治疗为辅，降低幼龄鳄鱼的发病率，这对鳄鱼养殖业的健康养殖尤为重要。

鳄鱼的气单胞菌感染发病的文献报道仅见于嗜水气单胞菌引起鳄鱼的皮肤损伤、溃疡、出血、坏死性肠炎、肺炎和败血症[9]，嗜水气单胞菌之外其它气单胞菌感染尚未见报道，本研究从发病死亡的幼龄鳄鱼中，分离出简达气单胞菌，经过表型与分子生物学鉴定及致病性试验，首次确认了鳄鱼的简达气单胞菌感染。同时对该株简达气单胞菌的毒性进行了分析，显示其具有较强致病力。最后通过对鳄鱼感染的简达气单胞菌药敏分析，给出了相关防治措施。