抗EPO抗体特性、分类及其相关纯红细胞再生障碍性贫血的发病机制及诊治进展

张 晶 综述 张承英 审校

抗EPO抗体相关纯红细胞再生障碍性贫血是一种应用重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)而引起的纯红细胞再生障碍性贫血(pure red cell aplasia，PRCA)，临床上比较少见，其主要特点为rHuEPO治疗无效，呈进行性贫血，特点为外周血中网织红细胞及骨髓中红系前体细胞绝对缺乏，而粒系和巨核系细胞数正常。1922年，Kaznelson首次将PRCA从再生障碍性贫血中分出。本病临床上并不常见，其发病率约占再生障碍性贫血总数的3%[1]。随着rhuEPO在临床的广泛应用，由其引起的不良反应—抗EPO抗体相关纯红细胞再生障碍性贫血也越来越受到临床重视。笔者重点对该病的发病机制、诊断及治疗进展进行综述。

1 抗EPO抗体

1.1 特性 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种酸性糖蛋白，用于骨髓中红系造血祖细胞，能促进其增殖、分化。它由分子量为18 399的166个氨基酸的成熟蛋白组成，其分子量约为30 400。人类EPO 基因定位于7号染色体长臂22区(7q22)，含有5个外显子和4个内含子，细胞在分泌外显子编码的多肽时，将N-端27个氨基酸组成的前导肽剪切下来，经过移除末端氨基酸，在体内与骨髓红系前体细胞表面的特异受体结合，抑制骨髓红系前体细胞的凋亡，刺激骨髓红细胞的生成和释放，从而发挥生物学作用。1983年由Lin等[2]成功分离并克隆了EPO基因，1985年成功地克隆出人EPO互补脱氧核糖核酸(cDNA)和基因，开始利用基因工程技术表达了重组人EPO，即rHuEPO，并之后用于临床实验，1989年美国食品药品管理局(FDA)正式批准rhuEPO 应用于贫血的临床治疗。目前随着现代基因技术的发展，r-HuEPO已成功广泛应用于临床慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者，有研究显示，慢性肾脏病患者对EPO反应性的降低是疾病进展的主要原因，体内炎性反应因子也能不同程度地降低机体对EPO的反应性[3]，所以说EPO可显著延缓慢性肾脏病的进展[4-6]。此外，EPO还适用于癌症、化疗或者外科手术中异性输血导致的贫血、失血后贫血和AIDS引起的贫血等，也可降低患者对输血的需求，减少AIDS及病毒性肝炎等通过血液制品传播疾病的发生几率。

1.2 分类 临床使用最广的rHuEPO均为EPO基因经过体外重组后在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞中表达的糖蛋白，糖基对稳定蛋白的结构和生物活性非常重要，各种类型的rHuEPO氨基酸序列与天然EPO之间最主要区别为所含寡糖链的不同。rHuEPO可分为含寡糖39%的rHuEPO-α和含寡糖24%的rHuEPO-β，而抗EPO抗体介导的PRCA主要发生于前者。PRCA可分为原发性和继发性，原发性常与形态异常有关，由编码各种核糖体蛋白质的基因发生突变而导致[7]，继发性可见于肿瘤(如胸腺瘤、淋巴瘤等)、病毒感染(肝炎病毒等)、自身免疫性疾病、药物(如氯霉素、异烟肼、硫唑嘌呤等)、妊娠及rHuEPO相关等[8-10]，其原因可能跟T淋巴细胞功能异常，细胞因子分泌紊乱，致使骨髓产生受抑制有关[11，12]。

2 PRCA发病机制

目前，抗EPO抗体相关的PRCA发病机制尚不明确，研究发现其发病机制可能有以下方面：(1)给药途径。EPO相关PRCA患者的给药途径几乎均为皮下注射。其局部皮肤可出现变态反应，从而促使全身免疫反应产生抗体，因为淋巴细胞在皮下，与静脉给药相比，皮下注射更易增加药物的免疫原性，从而介导机体发生免疫反应[13]，但皮下注射EPO依然有其生物利用度高，减少过敏反应等不良反应的优势。(2)稳定剂成分。1998年为防止疯牛病等疾病的传播， Epre等[14]使用聚山梨醇酯80代替白蛋白做为稳定剂成分，之后 EPO相关的PRCA发病数量也升高，由此推测EPO抗体产生与稳定剂聚山梨醇酯有关，尤其是温度较高时，会引起rhuEPO分子聚集形成微粒，进入体内后触发机体的免疫系统反应，引起EPO 抗原性改变，从而诱导抗EPO抗体的产生，PRCA多见于使用rHuEPO-α患者，这可能是因为rHuEPO-α所含的聚山梨醇酯较rHuEPO-β高[15]，当然也有皮下注射rHuEPO-β，如达依泊汀或HX575后患PRCA的病例[16]。(3)产品包装。使用带有无涂层橡皮塞(uncoated rubber stopper)的预充型Eprex也和rHuEPO相关的PRCA有关。研究认为，无涂层橡皮塞中的某种有机化合物(钨或硅)能诱导蛋白质变性，导致蛋白质折叠形成聚合物，这对Eprex免疫原性的增加起到辅助作用，所以临床建议使用带有涂层橡皮塞的预充型Eprex，强化低温链以及改变应用途径。(4)其他因素。除上述原因，如透析管路、透析器，透析患者的微炎症状态，营养不良、电解质平衡紊乱，透析不充分，ACEI及ARB类药物及免疫抑制剂的使用，脾亢及甲状腺功能减退都能影响EPO抗体的产生。

3 诊断和治疗

3.1 EPO相关的PRCA诊断 EPO抗体相关PRCA的诊断除临床表现为应用rhuEPO过程中存在进行性贫血外，还要依靠骨髓象和血清抗EPO抗体的检查。其诊断标准如下：(1)持续使用rHuEPO治疗4周以上，在rHuEPO剂量不变或剂量增加时出现血红蛋白以每周 5～10 g/L的速度快速下降，或需每周输入1～2单位的红细胞才能维持血红蛋白水平。需排除透析不完全、缺造血原料等导致促红细胞生成素治疗反应低下的因素；(2)骨髓穿刺提示红系祖细胞小于5%，粒系和巨核系无明显改变；(3)化验抗EPO抗体阳性。同时满足以上3项即可诊断为PRCA。Slominski等[17]研究发现，血清中即使存在抗EPO抗体不一定会发生PRCA，抗EPO抗体所导致的PRCA患者也不一定应用过rHuEPO。

测定血清中EPO抗体水平，可了解其发病机制，同时可为纠正患者贫血症状提供依据。EPO抗体的检测是诊断EPO相关的PRCA的重要依据。目前检测血清中抗EPO抗体有多种方法：(1)放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)是最早出现、最精确的检测方法，特异性高，但易出现假阴性；(2)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)应用广泛，但其灵敏度和特异性均低于RIPA；(3)生物传感器免疫分析法(Biosensor immunoassay)操作复杂，灵敏度低，应用受限；(4)体外分析法是最直接的检测方法，但不能精确分析抗体滴度及亚型。近年新兴的光激化学发光免疫分析法(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)展示了未来检测技术的发展趋势，具有灵敏度高、操作简便、性质稳定、易于微型化自动化等优势。

3.2 治疗 本病一旦确诊后治疗上首先应停用或避免应用所有种类的rhuEPO，并对严重贫血患者进行输血对症治疗，治疗缓解后仍应继续停用 EPO 以免复发。Verhelst等[18]发现，除停EPO治疗外，给予免疫抑制剂治疗后，78%PRCA患者的抗EPO抗体转阴，血红蛋白较前有所升高。有文献报道环孢素治疗PRCA有效率为82%,是目前公认的治疗继发性PRCA首选药，其机制可能是由于环孢素可逆性地抑制体内T淋巴细胞的功能和增殖，抑制淋巴因子的生成和释放，调节T细胞亚群比例，同时可抑制 CD8 细胞活性及增殖，使 CD4/CD8 的比例恢复正常，继而有效抑制骨髓造血，提高对激素的敏感性，减少不良反应的发生。两药联合应用可从各个方面排除各种免疫异常因素，疗效要大于单药治疗。但应注意长期应用免疫抑制剂会致免疫功能低下，易合并各种感染，治疗过程中要监测淋巴细胞亚群。我院有报道显示肾移植术后联用吗替麦考酚酯和他克莫司导致PRCA的病例，换用环孢素后骨髓涂片及血常规恢复正常[19]，也有部分报道显示仅使用少量激素(泼尼松龙0.2 mg/kg)维持3个月病情得到缓解的病例[20]。Hirokawa等[21]报道 PRCA的患者初始免疫抑制治疗缓解率显著要高于复发后2次免疫抑制治疗缓解率，治疗中尤其要注意患者初始的病因治疗及针对发病机制的免疫抑制治疗，防止2次复发。采用肾移植治疗PRCA患者缓解率达100%，其疗程也在1个月内，提示肾移植治疗方案非常可行，但因肾源缺乏，肾移植治疗PRCA受到限制，此时可单用环孢素、环孢素+激素、激素+环磷酰胺进行治疗，治疗应一直持续到复查抗EPO抗体转为阴性，网织红细胞计数>20×109/L。近期我院1例PRCA患者经激素联合环孢素治疗，3个月内血红蛋白恢复正常，化验环孢素谷浓度平均为132.5 ng/ml，取得了比较好的治疗效果。此外，大剂量静注人血免疫丙种球蛋白(HD-IVIG)、血浆置换及单克隆抗体等生物制剂也为治疗治疗提供了可能。总之，应结合发病原因及免疫学情况确定PRCA具体的治疗方案。

目前针对抗EPO抗体相关纯红细胞再生障碍性贫血的精准治疗方案亟待进一步研究，近年来，在低氧诱导EPO基因的方面合成的缺氧诱导因子-脯氨酰羟化酶(HIF-PH)抑制剂，可上调EPO基因的表达，用于治疗慢性肾脏病以及终末期肾病(ESRD)导致的肾性贫血患者，临床上可减少PRCA的发生，相比于传统的红细胞生成素刺激药(erythro poiesis stimulating agents，ESAs)，其造价便宜，给药途径方便[22]，通过模拟缺氧状态，抑制HIF羟化降解的路径，从而达到激活HIF，诱导EPO合成的目的，从而纠正贫血[23]。另外促红细胞生成素拟肽(erythropoietin mimetic petide,EMP)中的代表药物Peginesatide因其氨基酸序列与天然Epo氨基酸序列不存在同源性[24]，因此降低了引起PRCA的风险，可应用于抗EPO抗体相关纯红细胞再生障碍性贫血患者的治疗[25]。

综上所述，抗EPO抗体相关PRCA呈逐年上升趋势，临床应引起警惕。对于EPO持续治疗无效，出现血红蛋白及网织红细胞计数绝对值进行性下降，而粒系和巨核系细胞数正常的患者应考虑PRCA可能，尽快完善骨髓穿刺及抗EPO抗体检查，一旦确诊应立即停用 EPO，治疗上需结合患者的原发病、疗效及药物耐受情况采用个体化治疗方案，若治疗无效，可行肾移植治疗。随着EPO基因精准治疗的发展，更多安全有效的药物将会被应用于临床，以使得更多的PRCA患者受益。