鸡巴氏杆菌的分离鉴定及体外抑制实验

边彦超，刘小兰，康绍珠，李雅婷，梁诗毅，曹刚，陈飞虎，陈林文，朱芝秀

（江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045）

鸡巴氏杆菌病，又称鸡出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡、火鸡等多种禽类的传染病。患病动物和带菌动物是本病的重要传染源，病死率较高，没有明显的季节性，但在气候剧变之时多发。本病多呈散发或地方性流行，同种动物之间相互传染，不同种种动物间偶见相互传染［1］。

图1 皮肤、黏膜、浆膜出血

图2 胸腔积液

图3 肝针尖状坏死

图4 心肌、心冠脂肪、心内外膜点状出血

图5 肠道弥漫性出血

2015年5月中旬，江西南昌某养鸡场发生疑似鸡巴氏杆菌病病例，剖检发病鸡可见全身皮肤、黏膜、浆膜点状或片状出血（图1）；胸腔积液，有纤维素性渗出物 （图2）;肝表面有密集的针尖大小的灰白色的坏死点（图3）；心肌、心冠脂肪、心内外膜点状出血（图4）；肠道弥漫性出血（图5）。临床上呈急性败血性死亡症，初诊为鸡巴氏杆菌病。取坏死肝脏无菌操作细菌分离，进行实验室诊断，确定为由多杀性巴氏杆菌引起的鸡出血性败血症。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：死亡鸡，来自江西南昌某养鸡场；实验鸡，购自江西农大动科院养禽小组。

1.1.2药品及试剂：5%兔血琼脂培养基、普通琼脂培养基、普通肉汤琼脂培养基（自行配制）；麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基（北京奥博星生物责任有限公司）；药敏试纸、微量发酵管（杭州天和微生物有限公司）；鸡唾液乳酸杆菌由江西农大动科院预防兽医教研室保存。

1.1.3实验仪器：AIR TECH超净工作台 （苏净集团安泰公司）；COCI光学显微镜 （重庆光学仪器厂）；Motic数码显微镜 （麦克奥迪实业集团有限公司）；HH.BII.420BS电热恒温培养箱（上海跃进科学仪器厂）；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 方法

1.2.1细菌分离培养：采取病死鸡的肝、脾、心等组织，触片、瑞氏染色；同时无菌操作划线接种于5%兔血琼脂培养基、TSA培养基和麦康凯培养基，37℃恒温箱培养24 h，观察菌落的形态、大小、溶血状况等，挑选单个典型菌落进行革兰氏染色、镜检，观察其菌体形态特征。挑取经过革兰氏染色后的单个菌落，划线接种于5%兔血琼脂平板，放入生化培养箱，37℃培养24h，进行纯培养。纯培养后的分离株分别命名为 JX01、JX02、JX03、JX04、JX05。

1.2.2分离菌生理生化特性：将分离菌分别接种至微量生化反应管中，37℃恒温箱培养24～48 h，观察其生长变化情况，方法按微量生化反应管说明书进行，发酵管分别加入1～2滴无菌血清。

1.2.3体外抑菌实验

1.2.3.1分离菌药敏实验：按照琼脂扩散法［2］做药敏试验，将分离菌血清肉汤培养液分别涂抹5%兔血琼脂培养基，37℃恒温箱培养24 h后，测量其抑菌圈的大小。

1.2.3.2鸡唾液乳酸杆菌对分离菌体外抑制实验。将分离菌分别接种于血清肉汤培养基，37℃培养24h后，均匀涂抹于血清琼脂培养，其上放置牛津杯，将鸡唾液乳酸杆菌加入牛津杯至满，37℃恒温箱培养24h，观察并测量抑菌圈大小。

1.2.4致病性试验：将分离菌无菌操作，接种于血清肉汤培养基，放入生化培养箱，37℃培养24h。分别取0.5mL血清肉汤培养物，肌肉注射3只健康试验鸡;同时，分别取0.5mL血清肉汤培养物，口腔喂服3只健康试验鸡，24h观察其发病情况。并将发病死亡的试验鸡进行细菌分离培养，染色镜检。

2 结果

2.1 分离菌培养特性

病死鸡的肝、脾、心等组织瑞氏染色镜检，均可见菌体呈两端钝圆、两极浓染的椭圆形小杆菌（图7），疑为巴氏杆菌。兔血琼脂平板和TSA培养基上均分离到形态一致的菌落。兔血琼脂平板上菌落生长良好、不溶血，呈半透明、湿润、似露滴状，表面闪光（图8）；TSA培养基上菌落直径在1 mm左右、灰白色、湿润、光滑；麦康凯培养基上不生长。单个菌落染色镜检，均为革兰氏阴性短杆菌，菌体两端钝圆，大小为 0.25～0.4μm×0.5～2.5μm，单个或成双排列（图 9）。

图6 乳酸菌体外抑制

图7 瑞氏染色（10×100）

图8 闪光小菌落

图9 革兰氏染色（10×100）

2.2 分离菌生理生化鉴定

实验结果：靛基质、枸橼酸盐、尿素酶等阴性；分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，产酸不产气；对乳糖不能分解；能还原硝酸盐。见图10、表1。

表1 分离菌生理生化特性

2.3 分离菌药敏实验

结果如表2，分离菌对大部分抗生素耐药；对青霉素G、羧苄青霉素、阿莫西林等青霉素类抗生素完全耐药；对卡那霉素、红霉素、氧氟沙星中等敏感。

2.4 鸡唾液乳酸杆菌对分离菌体外抑制实验

表2 药敏试验结果 mm

5 株分离菌的抑菌圈分别为：24、26、25、31、 33mm，如图 6。

图10 分离菌生化试验

图11 鸡胸腔积液

图12 心包积液,肝脏坏死点

图13 食道浆膜出血

图14 气管环死出血

2.5 致病性试验

3只肌肉接种0.5mL致病菌液健康鸡12d内死亡，3只口腔喂服鸡24d内死亡。解剖口腔喂服死亡鸡，可见胸腔有橙黄色透明的积液(图11);心包内有大量橙黄色透明液体，肝脏有大量坏死点(图12)；食道浆膜出血(图13);气管环出血(图14)。从试验鸡肝脏中分离到与原分离菌染色形态、培养特性完全一致的的细菌。

3 讨论

3.1根据临床病理特症，分离菌形态特性，菌落培养特性及生化试验、药敏试验、致病性试验等试验结果，比对伯杰氏细菌分离鉴定手册［3］，确诊该分离菌为多杀性巴氏杆菌。

3.2本分离菌与多杀性巴氏杆菌标准菌株生理生化特性大部分一致［4～6］，只有个别糖发酵试验［19］以及硫化氢试验［20］不同，可能因为菌株变异造成。

3.3分离菌对青霉素G、羧苄青霉素、阿莫西林等青霉素类抗生素完全耐药，与杜冬华发表的论文［18］相同，与刘红玉发表的论文［15］不同；对卡那霉素、红霉素、氧氟沙星中等敏感，与黄忠森［16］发表的论文相同，与马增军［17］发表的论文不同。这可能是由于地域、菌株差异等造成。

3.4长期以来，在临床上大量使用抗生素，造成分离菌耐药性越来越强［7～10］，寻找减少或取代抗生素的有益菌迫在眉睫。本实验所做的乳酸菌体外抑制实验取得了的较好效果，可为后期运用于临床提供理论根据。

3.5本分离菌致病性试验，实验动物呈急性出血性败血症，病变剖检发病鸡可见全身皮肤、黏膜、浆膜点状或片状出血；胸腔积液，有纤维素性渗出物;肝表面有密集的针尖大小的灰白色的坏死点；心肌、心冠脂肪、心内外膜点状出血；肠道弥漫性出血。急性败血性死亡症，与宋晓娜发表的论文［21］一致。分离菌致病性强，注射12h就可引起鸡死亡，为强毒株。

3.6由多杀性巴氏杆菌引起的鸡巴氏杆菌病，对多种动物如鸡、鸭、鹅、火鸡等都具易感性［11～14］。 因此，不宜混养。平时，应加强饲养管理，做好免疫接种，定期肌肉注射禽霍乱蜂胶灭活疫苗1mL/只［1］。发生疫病时，应立即隔离患病禽，严格消毒其污染的场所，进行紧急治疗，有条件的养殖场应做药敏试验选择有效药物全群给药。坚持全进全出的饲养制度。

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