黄连抗菌活性成分研究

谢川东 文燕 曾昱伟 王星 高盼奇 陈红英

摘要：为探究黄连（Coptis chinensis Franch.）抗菌活性的物质基础，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为试验菌进行抗菌活性测试，对黄连不同的溶剂提取物、组分、化合物进行分析。结果表明，黄连对两种菌均有一定的抗菌活性，不同试验样品对两种菌的抑菌趋势一致，在同一试验浓度下，对金黄色葡萄球菌的抑制活性明显强于大肠杆菌。具体表现为100%醇提物>50%醇提物>水提物;不同组分中，总碱的抗菌活性最强，而总碱和多糖显示微弱的抗菌活性;对总碱进一步分离得到4个生物碱（小檗碱、黄连碱、巴马亭、表小檗碱），其中小檗碱和黄连碱对两种试验菌的活性最强，但在同一浓度下，小檗碱活性弱于总碱。黄连抗菌活性成分主要来源于生物碱部分，不同成分之间可能存在协同抗菌关系。

关键词：黄连（Coptis chinensis Franch.）;小檗碱;组分;生物碱;抗菌

中图分类号：R282         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）23-0085-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.019           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

由于人类在抗炎症疾病和农渔牧业养殖中不合理使用抗生素，导致耐药菌株不断增加。目前，临床上可供选择的抗菌素越来越少。在人类与疾病的抗争史中，中草药用于炎症的治疗有明确记载。从中草药中发现新的抗菌药成为很多医药学者研究的目标。

黄连，为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）的干燥根茎。因其根茎呈连珠状而色黄，所以称之为黄连，是一种临床常用的抗菌抗病毒中药。黄连抗菌谱很广，对革兰氏阳性菌、阴性菌、各型流感病毒及真菌类均有一定的抑制作用[1]，其主要成分为异喹啉生物碱，其中小檗碱含量较高。小檗碱又名黄连素，有良好的抗菌效果。有研究报道，黄连对幽门螺杆菌的体外抗菌活性优于小檗碱[2]。前期试验发现，黄连降糖、抗氧化活性均优于小檗碱[3，4]。为探讨小檗碱以外的黄连抗菌成分，本试验以革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coil）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为指示菌，对黄连不同极性的组分进行抗菌活性跟踪，以期为这方面研究提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

黄连购于四川省天府神龙中药饮片有限公司。菌种金黄葡萄球菌和大肠杆菌由西南科技大学生命科学与工程学院菌种储藏室提供。

紫外分光光度計（UV2400型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;高速逆流色谱（TBE-300B型，上海同田生化有限公司）;微量分析天平（TP-214型，美国丹佛仪器有限公司）;超声清洗机（KQ32002型，昆山市超声仪器有限公司）;高压灭菌锅（MLS-3780型，日本三洋公司）;恒温培养箱（DHP-9162型，上海齐欣科学仪器公司）;超净工作台（SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司）。

小檗碱、巴马亭、黄连碱、表小檗碱标准品均购于上海纯优生物科技有限公司，纯度均大于98%。链霉素和红霉素药敏纸片购于北京普纳德科技有限公司，其余试剂均为分析纯。

1.2  方法

1.2.1  不同溶剂的提取  精密称取适量过筛的黄连粗粉100 g 3份，分别用适量的水、50%乙醇、无水乙醇在70 ℃下超声提取1 h，再用相应的溶剂配成1 g/mL的药剂。

1.2.2  黄连不同组分的制备

1）提取流程：黄连粉碎过筛后，取黄连粗粉适量，按照以下工艺流程分别制备极性不同的黄连组分，如图1所示。经过不同流程，黄连粗提物被分为黄连总碱、非生物碱、多糖3个部分。

2）多糖的提取与分析

多糖的提取：精密称取粉碎至20目的黄连粗粉100 g，置于索氏提取器中，用3倍超纯水回流脱脂6 h。按照参考文献[5]的方法提取制备黄连多糖。

定性分析：Molish试验进行检测。如样品含有糖类成分，将在液面交界处很快出现紫红色环。摇匀后颜色变深，冷却后加水稀释会出现暗紫色沉淀。

定量分析：参看文献[6]苯酚-硫酸法测定总糖的含量。平行测定3次取平均值。

3）黄连中总碱和非生物碱的提取：按照上述工艺流程，参照文献[7]的方法，提取制得黄连非生物碱，参照文献[8]的方法得到黄连总碱。

1.2.3  抗菌活性试验

1）药液制备：精密称取黄连分离得到的不同组分，用少许去离子水超声溶解，分别配成1、2、5   mg/mL的浓度。不同溶剂的黄连提取物均为1 g/mL的生药浓度。

2）含药纸片的制备：取一定数量的滤纸片（直径6 mm），分别加入上述制备的不同浓度药液，完全浸泡纸片2.0 h，吹干，高温灭菌30 min，取出放在紫外通风橱中吹干备用。用相同的溶剂浸泡纸片同法操作，作为阴性对照。

3）菌悬液的制备：取活化好的大肠杆菌和金黄葡萄球菌的平板洗涤，通过麦氏比浊和显微镜计数的方法配成1.0×108 cuf/mL菌悬液备用。

4）滤纸片法：准确吸取菌液0.1 mL均匀涂布于琼脂平板培养基的全部表面，用灭菌镊子将制备好的滤纸片贴于琼脂平板表面，置于37 ℃培养箱培养18 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。每个菌种重复3次，求均值。

1.3  色谱分离

对抗菌活性最强的总碱组分，采用高速逆流色谱法（HSCCC）进行分离纯化。以氯仿∶甲醇∶0.2 mol/L盐酸（2∶1∶1）的比例配置溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相。精密称取适量总碱，用流动相溶解配置成20 mL溶液。参照文献方法[3]，温度25 ℃，转速850 r/min，流速2 mL/min，检测波长254 nm，待两相体系达到平衡后，将样品溶液注入主机中，根据色谱工作站图谱收集各色谱峰。

各色谱峰的定性与定量按照中国药典（2015版）用TLC法和HPLC法的相同条件进行。

1.4  MIC测定

将上述色谱分离制得的色谱峰溶液减压浓缩至干后，配成4.00 mg/mL的药液。参照文献方法[9]，按倍比稀释法，用肉汤液体培养基将药液分别稀释为10个浓度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，   1∶256，1∶512，1∶102 4。试验用试管分别加入液体培养基100 μL，试验菌液20 μL，药液120 μL，混匀后，置于37 ℃培養24 h。肉眼观察每支试管的澄清度。

2  结果与分析

2.1  不同溶剂提取物抗菌活性

当黄连提取物浓度为1 g/mL时，不同溶剂提取物对2种试验菌均有抑菌效果，其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性明显优于大肠杆菌，具体结果见表1。不同溶剂提取物分别对2种菌的抑制趋势一致，其活性强弱从大到小均为100%醇提物>50%醇提物>水提物。水提物对大肠杆菌没有抗菌活性。

不同溶剂提取黄连，提取的成分明显不同。根据性相近则相容的原则，水提物含有多糖、蛋白质、氨基酸、多酚、生物碱、木质素等成分，而无水乙醇提取物中，多糖、蛋白质等大分子物质几乎未被提出，主要是小分子有机物，含水醇提物的成分介于二者之间。从上述结果看，对2种试验菌有抑菌活性的主要是小分子的有机物。为进一步了解黄连抗菌活性成分，用化学方法把黄连分成不同极性组分。

2.2  黄连组分提取分离结果

将黄连按照试验流程分成3个组分：多糖、非生物碱、总碱。多糖为大分子，生物碱为黄连的主要组分，非生物碱是除掉两者以后的其余部分。从100 g黄连粉末中，按照工艺流程得到3.15 g黄连总碱，1.23 g非生物碱，0.51 g多糖。多糖的定性试验显示有明显的紫色环。葡萄糖对照品标准方程为y=12.24x+0.067 6，r2=0.999， 其中y代表吸光度，x代表葡萄糖浓度（mg/mL）。粗多糖中多糖的含量为29.31%。

2.3  组分抑菌活性结果与分析

3种组分总碱、非生物碱、多糖的试验浓度均为5 mg/mL，用总碱、非生物碱、多糖制作的药敏纸片载药量为50 μg/片，组分抑菌活性结果见下表2。从表2可以看出，在试验浓度下，黄连多糖和非生物碱对2种试验菌都不敏感，而黄连总碱的抗菌活性较为明显，对2种菌表现高度的敏感。非生物碱和多糖的表现较弱，这与前面水提物的活性不如醇提物的活性结果一致，黄连抗菌活性主要贡献来源于总碱。普遍认为，黄连主要成分小檗碱对痢疾杆菌、炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌以及脑膜炎双球菌等均有较强抑制作用[10]。从上述结果看，在同样试验条件下，小檗碱对2种试验菌的活性明显弱于黄连总碱，这说明黄连总碱中还有其他成分与小檗碱协同起抗菌作用。

2.4  总碱分离结果

黄连总碱通过高速逆流色谱仪进行液液色谱分离，无损分离纯化，按照馏出峰进行收集。色谱分离结果见图2。共收集4个色谱峰的黄色溶液，分别浓缩重结晶后，经TLC和HPLC分析，与标准品进行比对，4个色谱峰分别为巴马亭、小檗碱、表小檗碱和黄连碱，纯度均大于96%，结果与文献[3]报道一致。这4个化合物均为黄连的生物碱，在中国药典中为黄连质控的主要指标成分，其结构式见图3。

在色谱分离过程中发现，溶剂体系的pH对色谱的出峰时间有很大影响。当体系pH由3变为2时，出峰时间可以减少2.0 h左右，而分离度变化不大。

2.5  4种生物碱的抑菌结果

4种生物碱均有抑菌效果，它们的最小抑菌浓度测试结果见表3。抑制金黄色葡萄球菌的活性大小顺序为为小檗碱、黄连碱>巴马亭、表小檗碱;抑制大肠杆菌的活性大小顺序为黄连碱>小檗碱>表小檗碱>巴马亭，与文献报道基本一致[11]。巴马亭、小檗碱、表小檗碱、黄连碱4种生物碱均为异喹啉生物碱，分子量分别为352、336、336、320 g/moL，分子量大小相似，不同的是结构差异。对这2种试验菌而言，可能亚甲氧基不利于细菌的生长，2，3位碳上亚甲氧基（R1+R2）的影响强于9，10位碳上的亚甲氧基（R3+R4）。从上述组分抑菌活性结果看，这4种组分彼此可能有协同抑菌的效果，也有可能这4种生物碱之外的微量组分有较强的抑菌活性。试验中也对黄连总碱HSCCC分离4种生物碱以外的馏分进行活性测试，但结果较弱。

3  小结与讨论

黄连对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌大肠杆菌，这与以往文献报道一致。当用不同溶剂提取时，黄连对2种试验菌的抑菌活性大小顺序为醇提物>50%醇提物>水提物;把黄连分成非生物碱、多糖、总碱时，发现这3种组分均有抑菌活性，其中总碱的抑菌活性最强，多糖的抗菌活性较弱。进一步将总碱分离得到4种主要生物碱，其中小檗碱和黄连碱对2种试验菌的活性较强，并且4种主要生物碱之间可能存在协同抗菌关系。

黄连有抗菌活性，不同溶剂提取物抗菌活性不同，这也说明黄连用不同炮制方法时，其抗菌活性也不同。黄连对多种细菌均有抗菌作用，但细菌不同，其抗菌成分有差异，说明不同成分作用于细菌的机理时不一样，但这都是体外试验。中药体内抗菌机理是一个复杂过程，涉及很多微生物及受生物体内环境的影响。现在研究认为，中药抗菌是对细菌、对机体多环节多途径作用的综合结果。少数中药抗菌与其有效成分直接作用于菌体有关，而大多数中药抗菌机理是激发生物体内在的其他抗菌因素，以及降低细菌毒力或者减轻细菌对组织细胞的破坏作用等途径起到抗菌作用。

参考文献：

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