三角形五肽重复蛋白研究进展

黄俊然 黄文超

摘要：三角形五肽重复（PPR）蛋白是植物中一个庞大的蛋白家族，能够从RNA剪切、编辑、降解和翻译等多个方面影响细胞器中RNA的新陈代谢，PPR蛋白由连续的PPR基序构成，蛋白呈右手螺旋结构，具有与RNA单链结合的能力。随着研究的深入，人工设计合成PPR蛋白技术已经成熟，PPR蛋白与RNA结合的规律已较为清晰，人工PPR蛋白有望被开发成为细胞器中介导RNA调控的新型生物技术。

关键词：三角形五肽重复蛋白;RNA单链结合;细胞器RNA调控

中图分类号：Q74         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）23-0019-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.004           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

PPR（Pentatricopeptide-repeat）蛋白即三角形五肽重复蛋白广泛存在于植物中，在拟南芥中约有450个PPR基因，在水稻中约有430个。PPR蛋白从RNA剪切、编辑、降解和翻译等多个方面影响细胞器中RNA的新陈代谢[1，2]。PPR蛋白由2～30个连续的PPR基序构成，每一个典型的PPR基序包含35个残基，形成两个反向平行的α螺旋组成的发卡结构[3]。PPR蛋白分为两个亚家族：其中一个是P家族，它的所有PPR基序都由35个氨基酸组成，另一个是PLS家族，与P家族的区别在于它的基序由31～36个氨基酸构成，并且在其碳端还会有额外的结构域：E，E+以及DYW结构域[1]。对拟南芥中的PPR蛋白进行分析和归类，发现含有E，E+及DYW的PPR蛋白分别为191、145及87个。碳端的这些保守结构域的排列是有一定规律的，在其PPR基序的后面首先会接一个E结构域。而E+结构域必须是在E结构域之后，DYW结构域一般出现在E+结构域之后[4]。

1  PPR蛋白结构呈右手螺旋状

对拟南芥的PPR蛋白THA8L（thylakoid assembly 8-lke）进行蛋白结晶和晶体结构解析。THA8L蛋白，在叶绿体类囊体膜的生物进程中，参与特定的二类内含子的剪接。THA8L编码一个PLS家族蛋白，它由3个P型基序及两侧的L基序与S基序组成。THA8L的蛋白晶体显示，THA8L由11个α螺旋组成。而前10个螺旋主要有5个PPR基序形成，最后一个小的螺旋有助于保护前面PPR基序的10个螺旋结构。THA8L-RNA的复合体结构显示，THA8L是以二聚体的形式与其RNA底物进行结合[5]。

对PPR10的晶体结构研究显示，每个PPR基序的35个氨基酸形成一对近似反向平行的α螺旋，每个α螺旋都有4个螺旋转角，两个α螺旋之間由两个氨基酸形成的转角相连。单个PPR10蛋白由连续的发卡型PPR基序扭转排列而呈右手螺旋结构，两个PPR10能够以反向平行的方式形成同源的二聚体，一个PPR10的氮端与另一个PPR10的碳端临近，形成一个纵向为70？魡，横向为140？魡的椭圆形构造。每分子的同源二聚体结合两分子的psaJRNA。在与psaJRNA结合时，蛋白结构会稍微改变，氮端和碳端向中心压缩，轴向减少20？魡的距离，这一结构上的改变使中间呈现中空的圆筒状结构，以适应与单链RNA的结合。从结构研究中还发现，PPR10与psaJRNA的结合从蛋白的第三个PPR基序开始[6]。

对拟南芥定PRORP（protein-only RNase P）的晶体结构研究。PRORP1定位在线粒体中，其包含了PPR结构域、锌结合结构域和典型的金属核酸酶结构域。PRORP1蛋白呈“V”型，两个臂（长度各约70？魡）形成约56°的夹角，第一个臂包含了5.5个PPR基序，以11个α螺旋的形式存在于此蛋白的氮端，第二个臂为平行的β折叠两侧伴以α螺旋，两个臂相汇的中心区域由反向平行的β折叠构成。仅在植物的PRORP1中发现，第一个臂的PPR结构域与中心区域的β折叠之间有一段32个残基的插入，形成链-螺旋-链的结构，这一带正电荷的结构以疏水键的方式与PPR结构域相互作用，以离子键的方式与中央结构相互作用，促进PPR结构域和金属核酸酶结构域的协调，使其发挥最佳的催化活性。与所有的PPR基序结构类似，PRORP1中连续的PPR基序也形成了右手超螺旋的结构，在蛋白中成了一个内凹面，面向金属核酸酶的活性位点[7]。

2  PPR蛋白影响目的RNA代谢

PPR蛋白被认为从维持稳定性，编辑和剪切等多个方面影响细胞器中RNA的新陈代谢。许多P家族的PPR蛋白具有RNA结合能力，并且在其碳端不具有其他的功能结构域，这样的PPR蛋白多是起到协助RNA修饰，维持RNA稳定或者促进其翻译的作用。LRPPRC是人体中已知的7个PPR蛋白之一，属于P型亚家族，含有30个PPR基序。因其对线粒体多数基因都具有转录后调控作用，以及它的隐性突变（A354V）会引起严重的幼儿线粒体相关神经退行而引起关注。LRPPRC与它的互作蛋白SLIRP能够形成异源二聚体，共同抑制PNPase和SUV3对mRNA的3′端发挥外切降解的活性，并且还能促进MTPAP（mitochondrial poly（A）polymerase） 介导的mRNA 3′端加尾延伸修饰。在研究中发现，当LRPPRC和SLIRP存在时，线粒体mRNA的3′端拥有更长的poly（A）尾，这暗示着LRPPRC和SLIRP能够通过抑制3′端脱腺苷化或3′端外切核苷酸的降解来稳定mRNA的活性[8]。在另一项研究中，发现蛋白SLIRP能够保持LRPPRC蛋白的稳定性，但与RNA的结合能力十分有限。此异源二聚体对RNA的结合能力主要依赖LRPPRC。另外，LRPPRC蛋白四分之二位置的PPR基序和SLIRP的RRM（RNA recognition motif）基序被证实是二者结合最紧密的位置[9]。LRPPRC与SLIRP所形成的异源二聚体能够结合几乎所有的线粒体mRNA，保持mRNA的结构稳定，并使mRNA上与蛋白翻译，维持结构稳定和多聚核苷酸化等有关的重要位点暴露，保证线粒体基因的正常表达[10]。PPR10在玉米的叶绿体中被发现，归属于P型亚家族，包含19个PPR基序，能够结合atpI-atpH和psaJ-rpl33两个转录本的基因间区，所结合的位置具有相似的序列特征，在PPR10的结合下，atpI-atpH和psaJ-rpl33的转录本获得更好的稳定性[11]。

PPR蛋白介导RNA的编辑，在拟南芥中发现的MEF35，包含11个PPR基序的PLS型蛋白，在其碳端存在一个E结构域和一个DYW结构域。它能够对核糖体亚基基因rpl16转录本的第209位核苷酸，细胞色素b基因cob转录本的第286位核苷酸和复合体Ⅰ亚基基因nad4转录本的第1 373位核苷酸进行脱氨反应，实现碱基由胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U）的编辑，以保证这三个基因的正常表达[12]。小立碗藓的线粒体转录组中存在11处RNA编辑位点，这11处RNA编辑位点的正常编辑，需要至少8种具有DYW结构域的PPR蛋白参与。其中PpPPR_65参与了两处临近的RNA编辑位点的编辑：ccmFc-C103和ccmFc-C122。PpPPR_65含有15个PLS特征的PPR基序，在碳端融合了E/E+结构域和DYW结构域，它能够识别ccmFc-C103上游的位点，将PpPPR_65敲除后，能够检测到ccmFc-C103和ccmFc-C122这两处的编辑现象完全消失。PpPPR_98，包含21个PLS型PPR基序，碳端融合了E/E+结构域和DYW结构域，在PpPPR_98的干涉表达系中可以检测到atp9-C92位点的编辑效应降低了30%，而余下的10个RNA编辑位点没有受到影响，进一步研究发现，PpPPR_98能够结合在内含子剪切完成后的atp9RNA上，而剪切前的atp9无法被PpPPR_98结合，推测PpPPR_98是在atp9mRNA剪切完成后，参与到第92位胞嘧啶的编辑中[13]。

PPR蛋白参与RNA的剪切。在玉米的叶绿体中发现的一个较小的PPR蛋白THA8（thylakoid assembly 8），只包含4个PPR基序。研究证实THA8在ycf3和trnA的二型内含子的剪切过程中起作用，将它突变之后，可以观察到ycf3-2的剪切现象完全消失，trnA的剪切效果大幅降低。进一步研究发现，THA8不能与ycf3或者trnA的单链RNA结合，但是能够与剪切因子WTF1和RNC1相互作用，这两个剪切因子同样参与到了对trnA内含子的剪切中[14]。玉米和拟南芥中的另一个PPR蛋白OTP51同样参与到了ycf3转录本内含子的剪切中，ZmOTP51包含10个PPR基序（AtOTP51包含7个PPR基序）和位于碳端的两个LAGLIDADGs结构域，LAGLIDADGs结构域被报道具有核酸内切酶活性，在拟南芥中仅有三个蛋白含有此结构域，但是AtOTP51的LAGLIDADGs结构域中缺少维持其核酸内切酶活性的几个关键残基，将otp51基因敲除突变后发现对剪切效率的影响远不如分别对crs1，wtf1和rnc1等剪切因子基因突变后的效果显著，推测其在对ycf3转录本内含子的剪切过程中仅仅起到辅助的作用[15]。

还有部分PPR蛋白，因其具有特殊的功能结构域，对RNA具有相应的作用。PRORP 1（Proteinaceous RNase P 1），含有5.5个PPR基序，在其PPR结构域之后还具有锌结合结构域和典型的金属核酸酶结构域，研究发现它具有RNase P活性，在人体中，以促进tRNA5′端成熟的形式来对线粒体tRNAs的前体进行加工，在拟南芥中以相同的形式介导所有tRNA的加工。在多数的真核生物中，PRORP都由核基因编码，但是在酵母的线粒体基因组中也发现了RNase P的RNA。将PRORP1的氮端8至11个α螺旋截短后，发现大大降低了它对pre-tRNA的结合能力，同时也影响了PRORP1的催化活性，但没有明显降低此蛋白与锌的结合。由于PRORP1中PPR结构域与蛋白的催化位点较远，因此认为PPR结构域在此蛋白中的主要作用就是增强了对pre-tRNA的结合能力[7]。

3  PPR与单链RNA的结合规律

PPR蛋白普遍具有与单链RNA结合的能力，随着研究的深入，PPR基序识别特定核苷酸的规律也逐渐清晰，目前认为，一个PPR基序可以特异性的识别一个核苷酸。

3.1  PPR基序特定残基与核苷酸结合

在早期对PPR10的结合单链RNA：PSAJ和ATPH的序列特征进行研究发现，它们的5′端和3′端的序列十分相似。识别的序列都从5′-GUAU-3′开始，且3′端的序列为5′-AUUUC-3′，早期从PPR10晶体结构上进行分析，認为一个RNA核苷酸会接近四个残基，分别是：临近的两个PPR基序上的第2位残基，以及与这一个核苷酸对应的PPR基序上的第5位和第35位残基。这些残基的不同组合，可以赋予PPR基序识别与之对应的特定核苷酸的能力[6]。随着越来越多的PPR蛋白和其结合的RNA序列被研究，发现每一个基序的第5位和第35位残基最具有特异结合氨基酸的能力，为了进一步确定PPR基序识别氨基酸的关键残基和识别“密码”，Shen等人用保守的残基序列作为PPR基序的骨架，只改变每个PPR基序的第5位和第35位残基（或者第6位和下一个基序的第1位残基），设计并表达了四种人工表达的PPR蛋白，用以和特别设计的单链RNA进行体外互作验证，确认了以下识别密码：当第5位和第35位残基分别是ND，NS，SN和TD时，能够对应识别氨基酸U，C，A和G。对这些人工设计的PPR蛋白进行晶体结构研究后发现，不同于PPR10以同源二聚体来结合两分子单链RNA的模式，它们以单个蛋白的形式来结合目的单链RNA，从空间结构分析来看，每个PPR基序的第5位和第35位残基与氨基酸环状官能团十分靠近，进一步研究分析发现PPR基序与腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）的结合的强度要强于与尿嘧啶（U）和胞嘧啶（C）的结合，因为在与嘧啶的结合中，还需要一分子水来参与形成氢键，而与嘌呤可以直接形成氢键，并且相较于与腺嘌呤A结合时形成两个直接的氢键，PPR基序与鸟嘌呤G结合时能形成三个氢键最为稳定[16]。PPR基序第5位和第35位残基（或者第6位和下一个基序的第1位残基）的不同组合对应识别核苷酸类型在表1中列出。

3.2  人工设计PPR蛋白与单链RNA结合的特点

与RNA的特异结合，使PPR蛋白具备发展为生物技术工具的潜力。近期备受关注的由引导RNA介导的（CRISPR）-Cas9基因编辑技术，能够实现对核基因进行特定碱基的编辑，实现对碱基进行替换，切除或者添加，但是无法对细胞器中的基因进行编辑。而PPR蛋白不需要引导RNA的介导，可以直接通过不同的PPR基序排列，识别特定的单链RNA，并且PPR蛋白能够通过信号肽的帮助进入细胞器中行驶识别和结合单链RNA的功能。在与特定功能结构域融合表达后，在转录或者转录后水平上对细胞器基因的表达进行调控。在最新的研究中，Miranda等人设计了4个人工PPR蛋白，每个人工蛋白都以PPR10的第一个天然基序作为起始基序，后面接以不同数量的人工设计PPR基序，其中两个较长的蛋白都含有13个人工设计的PPR基序，这两个蛋白被设计结合同一RNA序列，但采用不同的PPR基序骨架，一个采用的基序骨架和Shen等人的研究中所采用的一样，是将所有的PPR基序进行序列比对后，留下各个位置保守性最高残基而得。另一个骨架的选取策略，是先将PPR基序按照其识别的核苷酸的种类（U，G，C，A）分成四类，然后将相同类别的PPR基序进行序列比对得到保守性最高的残基信息，作为设计这一类PPR基序的骨架。研究中发现，以不同的骨架策略设计的PPR蛋白，在对目标单链RNA的结合能力上没有明显区别。另外两个人工PPR蛋白含有10个人工PPR基序，用以研究PPR基序数量对PPR-RNA结合特异性与亲和性的影响，在采用Bind-n-seq实验将四个人工PPR蛋白与大量的随机单链RNA进行体外结合并测序研究后发现，当PPR基序数量为10个时，能够在结合的特异性和亲和性之间达到一个较好的平衡，也就是说，当PPR基序数量大于10个时，PPR蛋白碳端的PPR基序与单链RNA的3′端之间会出现更多的非特异性结合，这一现象和增加CRISPR引导RNA长度的同时，它的碱基错配率也随之升高的现象相似。当PPR基序少于10个时，会降低PPR蛋白对目标单链RNA的结合强度，这一推测是基于之前的报道：天然的PPR蛋白至少需要6个PPR基序才能检测到RNA结合能力，如果在体外进行结合，则至少需要8个PPR基序[16，17]。在此研究中还证实，PPR-嘌呤的结合能力和结合特异性，都比PPR-嘧啶更强，PPR-鸟嘌呤的结合对整体结合的特异性和亲和力贡献最大。值得注意的是，PPR基序对错配的忍耐力还具有一定的位置效应：在对包含11个PPR基序的人工PPR蛋白与随机RNA序列结合的亲和性分析中发现，位于中间的PPR基序如果发生错配，对蛋白和RNA的结合产生的影响最显著，而位于蛋白两端，尤其是碳端的PPR基序发生错配，对整体的结合影响要相对小一些。PPR蛋白与单链RNA结合时，首先是从蛋白的氮端开始与RNA的5′端进行识别和结合，然后结合向蛋白的碳端/RNA的3′端进行延伸，对错配的忍耐力也随着增加，在超过10个配对之后，PPR基序-碱基错配的忍耐力变得显著而影响PPR蛋白与RNA单链结合特异性[18]。

4  PPR蛋白通过自身特殊的结构域或与蛋白互作来行使不同功能

PPR基序具有与单链RNA结合的能力，但对目的RNA的新陈代谢产生影响，需要通过其他的功能结构域或者与之相互作用的功能蛋白来实现。自身带有功能结构域的PPR蛋白，例如拟南芥中的PRORP1（Proteinaceous RNase P1）的碳端具有金属核酸酶结构域（NYN），其PPR结构域可以结合在pre-tRNAs的D/T-环上以保护RNA免受核酸酶的降解，同时NYN结构域可以对pre-tRNAs的5′端进行加工，最新研究发现位于此蛋白第439号位置的赖氨酸对pre-tRNA的切割活性十分重要，而正是PRORP1的切割作用促进目标成熟tRNA的形成[19]。另一类PPR蛋白在末端融合了一个MutS相关结构域（SMR），该结构域在先前的报道中发现其具有RNA或DNA核酸内切酶的活性。且SMR结构域不是融合在PLS亚家族的蛋白后面，而是融合在P亚家族蛋白的碳端。目前，在被子植物中只发现8个这样的蛋白[20]。拟南芥中OTP51蛋白碳端具有退化了的但是被报道具有核酸内切酶活性的LAGLIDADGs结构域。在PLS亚家族蛋白中常见的被认为参与RNA编辑的E/E+和DYW结构域，这些特殊的功能结构域都赋予了与之融合的PPR蛋白相应的生物功能。

另一方面，不包含功能结构域的PPR蛋白可以与其他蛋白相互作用或者影响其他蛋白的作用来行使自己的生物功能，例如人體中的PPR蛋白LRPPRC，它的互作蛋白SLIRP可以与之形成异源二聚体，共同抑制PNPase和SUV3两种核酸外切酶对 mRNA 的3′端发挥外切降解的活性，不仅如此，LRPPRC-SLIRP还能促进MTPAP（mitochondrial poly（A） polymerase）所介导的对mRNA 3′端加尾延伸修饰（8）。在玉米的叶绿体中，PPR10结合在atpI-atpH转录本的基因间区，在体外实验中发现，这一结合能够同时抑制5′端至3′端和3′端至5′端的核酸外切酶的降解作用。同时，由于PPR10的结合，导致RNA的二级结构发生改变，下游的核糖体结合位点被暴露出来，从而促进了被结合的基因的翻译表达[21]。玉米中发现的只包含4个PPR基序的THA8，参与到了两个基因ycf3和trnA的转录本二型内含子的剪切过程中，此蛋白因为只包含少量的PPR基序，不具备与ycf3或者trnA的单链RNA结合的能力，但是能够与剪切因子WTF1和RNC1相互作用，这两个剪切因子同样参与到了对trnARNA内含子的剪切之中[14]。红莲型水稻中的育性恢复蛋白RF5，属于PLS家族，不具有结合目标转录本atp6-orfH79的能力，但是其互作蛋白GRP162能够随其进入线粒体，与目的转录本结合，同时，具有WD40结构域的RFC3参与育性恢复蛋白复合体的构建，与RF5，GRP162以及未知的蛋白一起组建成400至500 kDa的复合体，它们共同介导atp6-orfH79转录本在第1169位核苷酸处切割，抑制雄性不育蛋白ORFH79的翻译表达[22，23]。另一个育性恢复基因Rf6，属于P家族PPR蛋白，包含20个PPR基序，与己糖激酶HXK6相互作用，研究发现RF6也能与其他蛋白组建成一个蛋白复合体，约400～500 kDa大小，并且RF6不与GRP162相互作用，暗示RF6和RF5所参与形成的蛋白复合体并不一样。RF6参与的育性恢复复合体，同样具有对atp6-orfH79转录本的剪切功能，于转录本的第1238核苷酸处进行切割，抑制ORFH79在线粒体中的积累，进而使雄配子正常发育成具备育性的成熟花粉[24]。

5  展望

（CRISPR）-Cas9是當下热门的基因编辑技术，但无法对细胞器中基因进行编辑。而PPR家族蛋白具备进入细胞器中与单链RNA结合的能力，并且识别结合RNA 4种核苷酸的部分PPR基序特点已被研究证实，还有更多的识别密码正在被研究和验证。在此基础上，针对靶标RNA单链序列特征，人工设计对应的PPR蛋白，通过融合相应的功能结构域，人工设计融合的PPR蛋白有望成为能够调控细胞器基因表达的新一代生物技术。

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