鸡场空气及粪便中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分布特征与影响因素

韩 帅 ，孙兴滨 ，陈 默 ，高 敏 ，王旭明

（1.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2.北京市农林科学院农业生物技术研究中心，农业基因资源与生物技术北京市重点实验室，北京 100097；3.中国农业大学生物学院，北京 100193）

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患条件致病菌。在临床上可引起人类皮肤组织感染、败血症、肺炎、肠炎、脑膜炎和中毒性休克综合征等疾病[1]。在动物养殖中可引起家畜乳房炎[2]、禽类关节炎[3]、外伤化脓性炎症、泌尿道感染[4]等多种疾病。严重侵害家畜健康，使畜牧业遭受重大经济损失[5]。1961年，英国的Jevons[6]发现了第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。MRSA含有mecA及其相关基因[7]，几乎对所有β-内酰胺类抗生素具有耐药性[8-9]，被称为“超级细菌”[10]。目前对感染MRSA的治疗已经成为最棘手的问题[11]。MRSA不仅可以感染人类，而且也是家畜感染的重要致病菌[12-13]。近年来，由于抗生素药物在养殖业的不规范使用，导致动物感染MRSA的事件逐年增加[14]。

随着我国经济不断发展和人们饮食结构的改变，以集约化、工厂化为主要养殖模式的现代化畜禽养殖场数量不断增加[15]。其中，蛋鸡数量已占全球的40%[16]。在高密度的养殖条件下，垫料、动物自身以及粪便中含有的包括病原菌或条件致病菌在内的微生物，通过风化、腐蚀、空气气流弥散等作用悬浮在空气中形成生物气溶胶[17]，引起动物或饲养员的感染[18]。这些微生物还可以负载到颗粒物表面，传播到舍外环境[19]，导致气源性传染病流行[20]，给附近居民健康带来极大威胁[21-22]。其中，动力学当量直径小于2.5 μm的颗粒（PM2.5）可直接深入到细支气管和肺泡，从而增加人和动物的发病率和死亡率[23]。因此，越来越多的学者开始关注颗粒物特别是细颗粒物负载的空气微生物[24-25]。

自首次发现以来，MRSA已成为爆发率最高的医院内感染病原菌之一，分离率可达55.73%[26]。动物中最先在患乳房炎的奶牛中发现MRSA[27]，之后相继在猪、牛、羊和鸡等动物中发现[28]。在欧洲地区的家禽、猪和牛肉类制品中MRSA的检出率达到27.3%、10.4%和9.6%[29]。目前有关MRSA的研究多集中在人医环境[30-31]和部分猪、牛、羊养殖环境[32-34]中的定殖情况、传播扩散与耐药机制。而对于家禽空气环境中的MRSA研究相对较少，尤其是细颗粒物负载MRSA以及其影响因素均未见报道。因此，本研究通过对北京地区一家蛋鸡养殖场进行等时间间隔连续采样，记录养殖环境中MRSA的浓度变化，分析其影响因素。

1 材料与方法

1.1 采样时间和地点

本研究在2016年7—11月期间，对北京平谷地区一家规模化蛋鸡养鸡场两栋鸡舍分别进行同时采样调查。鸡场所处位置地势平坦，其800 m辐射半径内不受较高建筑物及公路主干道影响。采样当日天气均为晴天。主要采集空气样本和相应粪便样本。两栋鸡舍饲养品种均为海兰蛋鸡，所处环境及养殖方式相同，采取笼上养殖，每个鸡舍内蛋鸡数量均在9300只左右，鸡舍采取机械通风，每周带鸡消毒2次。

1.2 采样方法和培养方法

生物气溶胶采集在清粪、喷淋消毒等作业开始前40 min完成。采集使用FA-Ⅰ撞击式采样器（辽阳，中国）。该仪器将空气中的带菌粒子按空气动力学直径大小分别捕捉在各级培养皿上，具体粒径分布信息如表1所示。采样高度距地面1.5 m，细菌与抗生素耐药菌样本采集时间经优化，分别为1 min和2 min，气体流量28.3 L·min-1，每次采样前用流量计（余姚，中国）对采样泵进行流量校正，每个采样点同时采集3个平行样本。采用相同方式检测舍内温度、相对湿度和各粒径颗粒物浓度，使用温湿度计检测（WD-35612，OAKTON，德国）。

1.2.1 鸡舍内空气中细菌及耐药菌的培养

样本采集选用9 cm培养皿，灭菌后加入20 mL培养基。细菌采用LB营养琼脂培养基，28℃培养2 d。金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均采用CHRMagar显色培养基（法国科玛嘉公司），37℃培养24 h，均选取培养基上呈红色、红褐色或粉红色的边缘光滑菌落进行计数[35-36]。采集样本在进行菌落计数时，采用Positive hole method方法进行菌落计数校正。取同一采样点3次计数校正后平均值计算出平均细菌浓度（CFU·m-3）。

表1 FA-Ⅰ撞击式采样器特征Table 1 FA-ⅠImpingement sampler characteristics

1.2.2 粪便中细菌及耐药菌的培养

收集与空气样本对应的新鲜粪便样本，采用五点法，将5个点采集的新鲜粪便混合均匀作为一个样本，冷藏运输。为使得粪便中细菌具有良好活性，取10 g粪便加0.8%灭菌生理盐水100 mL，37℃、160 r·min-1，摇菌12~16 h。得到的菌液取1 mL加入装有9 mL 灭菌生理盐水的离心管中，按 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀释，选取 10-5、10-6、10-7梯度菌液各100 μL用涂布棒均匀涂布在LB培养基上，每稀释梯度涂布3块培养皿，28℃培养2 d。选取10-3、10-4、10-5梯度菌液各100 μL用涂布棒均匀涂布于CHRMagar显色培养基上，每稀释梯度涂布3块培养皿，37℃培养24 h。在进行菌落计数时，选取各重复菌落计数相近且菌落计数在30~300个的稀释梯度平板为宜。采用Positiveholemethod方法进行菌落计数校正。取同一稀释梯度3次计数校正后平均值计算出平均细菌浓度（CFU·g-1）。

1.3 计算方法

1.3.1 空气中细菌气溶胶浓度

根据采样时间和气体流量，利用公式（1）计算各级生物气溶胶浓度。

式中：Ca为细菌或耐药菌气溶胶浓度，CFU·m-3；N 为各级菌落数，CFU；t为采样时间，min；F为采样时的气体流量，L·min-1。

1.3.2 粪便中细菌浓度

根据稀释梯度和样品质量，利用公式（2）计算粪便中细菌浓度。

式中：Cf为粪便中细菌或耐药菌浓度，CFU·g-1；N 为各稀释梯度菌落数，CFU；a为稀释倍数；10为实验样本质量，g。

1.3.3 耐药菌占总细菌浓度比例

式中：η为耐药菌所占比例；C为细菌或耐药菌浓度，CFU·m-3。

1.3.4 细颗粒物中耐药菌气溶胶所占比例

本研究将粒径 D50≤2.1 μm（stageⅣ）定义为细颗粒物。细颗粒物所负载耐药菌气溶胶比例（FBT）计算公式如下：

式中：BⅠ、BⅡ、BⅢ、BⅣ、BⅤ、BⅥ分别为分布在 StageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ粒径范围内耐药菌气溶胶浓度，CFU·m-3。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 21.0对数据进行Spearman相关性分析。当P<0.05时，表明在95%置信区间内具有统计学意义上的差异；当P<0.01时，表明在99%置信区间内具有统计学意义上的显著差异。运用逐步回归方法，建立鸡舍空气及粪便中与MRSA浓度相关影响因素的回归方程，R趋近于1表明此回归效果较好。

2 结果与讨论

2.1 鸡舍空气中MRSA特点

2.1.1 鸡舍空气中MRSA浓度及比例

本研究采集了蛋鸡舍内环境中总细菌（LB）、金黄色葡萄球菌（S）和MRSA气溶胶样本，并进行微生物培养和计数，对比分析上述细菌生物气溶胶浓度和比例随蛋鸡日龄的变化趋势，结果如图1所示。

由图1可知，在蛋鸡日龄分别为145、404 d检出舍内环境总细菌气溶胶浓度最低值和最高值，即总细菌气溶胶浓度变化范围在 1.9×103~3.8×104CFU·m-3。整体来看，总细菌气溶胶浓度随日龄增加呈上升趋势。其中，日龄分别为209、270、378 d所检测到的总细菌气溶胶浓度相比临近日龄浓度略有下降，但浓度差异小于1个数量级。本研究中所检测到的总细菌气溶胶浓度略低于莱芜市蛋鸡舍内浓度[21]，相比山西地区某牛场（2.1×102~5.26×103CFU·m-3）和羊场（3.7×102~5.55×103CFU·m-3）中空气细菌浓度略高[37]。值得关注的是，在较大日龄343 d和404 d所检测到的总细菌浓度高于我国《畜禽场环境质量标准》的细菌浓度界定值（2.5×104CFU·m-3）。金黄色葡萄球菌浓度的最低和最高值分别在日龄145 d和343 d检出，浓度分别为 2.8×102CFU·m-3和 2.19×103CFU·m-3，整体变化趋势与总细菌相似。该浓度变化范围与山西某牛场和羊场以及山东泰安市某鸡舍内检测到的浓度范围相近[37-38]。其中，在日龄分别为209、270 d和404 d所检测到的金黄色葡萄球菌浓度略有下降。据既往研究，养殖环境中的细菌会负载到细颗粒物（动力学当量直径≤2.5 μm），通过空气途径传播[19]。本研究检测到的金黄色葡萄球菌浓度变化可能是受到鸡舍内细颗粒物浓度变化的影响。在上述3个日龄下检测到的PM2.5浓度较前一日龄相比浓度均有下降，分别为6.93、2.77 μg·m-3和 4.23 μg·m-3。MRSA 浓度的检测结果显示，整体上，MRSA的平均值为（4.31×102±4.56×102）CFU·m-3，在 145~176 d，其浓度随日龄增加有升高趋势。在176~270 d，MRSA浓度由4.7×102CFU·m-3逐步下降到 80 CFU·m-3，310 d 浓度上升到最高值 1.15×103CFU·m-3，后逐步下降，404 d 检测到最低值 70 CFU·m-3。

图1 鸡舍内部空气中MRSA、金黄色葡萄球菌（S）和总细菌（LB）浓度及比值Figure 1 Concentrations and percentages of MRSA,Staphylococcus aureus（S）and total bacteria（LB）in air of layer house

由图1可知，与MRSA浓度变化趋势相似，在176~270 d，MRSA/LB由最高值5.47%下降到0.76%，310~343 d，MRSA/LB由1.84%上升到3.22%后逐步下降，404 d检测到最低值0.21%。在所检测的259 d中，MRSA/LB的均值为2.04%±1.72%。该值略低于已有研究对山东两个养鸡场检出具有耐甲氧西林抗性基因的金黄色葡萄球菌比例（4.2%和8.3%）[39]。MRSA/S比值在14%~95%之间，均值为41.99%±26.99%，该比率变化可能受到舍内温度的影响。在MRSA/S最高比例的第310 d，温度检测到最高值为29℃，当378 d温度为17℃时，检测到MRSA/S的最低值。S/LB变化趋势与MRSA/LB相似，在145 d和404 d检测到最高值与最低值，分别为14.4%和0.66%，均值为4.91%±5.89%。本阶段研究结果表明，MRSA/LB和MRSA/S的比值变化可能受到MRSA浓度及舍内温度的影响。在鸡舍环境中虽检测到金黄色葡萄球菌和MRSA，但二者占总细菌浓度比例较低。而在检测到的金黄色葡萄球菌中具有耐甲氧西林抗性的细菌平均比例高达41.99%，这一结果与以往研究对广东地区饲养场、屠宰场、肉类市场3种空气环境的研究（48.2%）结果相似[40]，低于医院环境中的MRSA检出率（55.6%和 57.1%）[26，31]。

2.1.2 细颗粒物表面负载MRSA比例

据流行病学研究，长期暴露在细颗粒物（动力学当量直径小于2.5 μm的颗粒）污染的环境中，可增加人和动物的发病率和死亡率[25]。因此，本研究对PM2.5所负载的MRSA浓度及比例进行计算分析，结果如图2所示。

由图2可知，PM2.5负载的MRSA浓度的变化规律与空气中总的MRSA浓度相似，其浓度范围在26~441 CFU·m-3之间，均值为（151±170）CFU·m-3。其中，PM2.5负载浓度的最高值与最低值检出日龄和MRSA浓度临界值检出日龄相同，分别在343 d和404 d。PM2.5负载MRSA比例变化范围11%~75%，均值为38.13%±20.17%，其中在日龄 244、270、343 d和 404 d的负载比例均高于40%，该负载比值说明MRSA浓度变化可能会受到细颗粒物浓度变化影响。

2.2 鸡舍粪便中MRSA浓度及比例

畜禽粪便被认为是养殖环境中抗性细菌存在的重要来源库，本研究在采集气溶胶样品的同时收集相同日龄的粪便样品，进行涂板计数后计算出相应浓度，并分析鸡舍粪便中总细菌、金黄色葡萄球菌及MRSA随蛋鸡日龄增长的浓度及比例变化。结果如图3所示。

如图3可知，在蛋鸡日龄增加过程中，粪便中细菌浓度虽有小幅度波动，但整体上粪便样品中总细菌、金黄色葡萄球菌以及MRSA的浓度均随日龄增加呈现上升趋势。总细菌浓度的变化范围在3.1×107~4.1×108CFU·g-1，其最高值及最低值分别在日龄343 d和145 d时检出，其浓度变化趋势与空气中总细菌浓度变化一致，说明粪便可能是鸡舍内空气中细菌主要来源。柳敦江[39]对泰安养鸡场舍内金黄色葡萄球菌的研究也得到了相似结论。259 d的检测结果显示，粪便中金黄色葡萄球菌浓度变化范围在1.6×104~2.3×105CFU·g-1，其最高值及最低值分别在404 d和176 d检出。其中MRSA浓度的最低值和最高值在同一天检测出，分别为 3×103CFU·g-1和 1.31×105CFU·g-1，其浓度平均值为（3.37×104±4.83×104）CFU·g-1。

图2 鸡舍空气中PM2.5负载MRSA浓度及比例Figure 2 Concentrations and percentages of MRSA on fine particles（PM2.5）in air of layer house

图3 鸡舍内粪便中MRSA、金黄色葡萄球菌（S）和总细菌（LB）浓度及比值Figure 3 Concentrations and percentages of MRSA,Staphylococcus aureus（S）and total bacteria（LB）in faeces of layers

与MRSA浓度变化相比，MRSA/LB和MRSA/S比值变化趋势虽波动较大，但二者比例的最高值仍在日龄404 d检出，分别为4.49%和57.75%。MRSA/LB比例变化范围为0.11%~4.49%，其中在日龄244、378、404 d所检测到比值较其他日龄高，该变化趋势与粪便中MRSA浓度变化相符。S/LB比例变化范围为3.72%~51.8%，MRSA/S的比例变化范围在4.375%~57.75%。以上3种比例的均值分别为1.82%±1.81%、13.67%±15.99%、22.11%±20.06%。本研究结果显示，蛋鸡粪便中的MRSA/LB与MRSA/S的比值均低于空气中所检测到的相应浓度比值，该结果可能与MRSA的存活率会受到养殖环境中不同介质影响有关。

2.3 鸡舍空气中MRSA影响因素

畜禽养殖环境中细菌气溶胶浓度可能会受到多种不定因素影响，其中包括温度、湿度及各粒径颗粒物浓度。本研究对上述所涉及到的影响因素进行监测，结果如图4所示。

由于样品来源于同一家养鸡场的两栋不同日龄鸡舍，温度受采样时季节变化的影响。由图4可知，蛋鸡日龄在145~270 d之间时，舍内温度由28℃逐步下降到13℃；在310~404 d之间时，舍内温度由最高值29℃逐步降到最低值12℃。在采样期间，温度的均值为（21.9±6.6）℃。湿度的变化范围为33%~71%，与温度变化规律相似，最高值与最低值检出日龄分别在310 d和404 d，均值为53%±14%。PM1浓度变化范围为 0.6~18.1 μg·m-3，均值为（6.73±6.19）μg·m-3，最高值与最低值检出日龄在310 d和404 d，变化规律与温度相似。PM2.5浓度变化范围为4.2~36.5 μg·m-3，均值为（16.14±11.59）μg·m-3，临界值检出日龄与 PM1相同。整体来看，细颗粒物浓度变化趋势与温度和湿度变化趋势保持一致。PM4浓度变化为9.2~55.6 μg·m-3，均值为（33.6±15.1）μg·m-3。PM7浓度范围为 20.3~169.3 μg·m-3，均值为（76.9±38.6）μg·m-3。PM10浓度范围为 54.1~332.6 μg·m-3，均值为（130.2±82.7）μg·m-3。总悬浮颗粒物浓度变化范围为111.6~919.8 μg·m-3，均值为（292.9±253.5）μg·m-3。其中总悬浮颗粒物与PM10颗粒物浓度均符合我国《畜禽场环境质量标准》。

本研究进一步考察了鸡日龄、温度和各粒径颗粒物浓度对鸡舍内总细菌、金黄色葡萄球菌以及MRSA的影响相关性。分析结果如表2所示。

由表2可知，空气中总细菌浓度与粪样中总细菌浓度呈显著正相关（P<0.01），而粪样中总细菌浓度与鸡日龄呈显著正相关（P<0.01）。因此，空气中总细菌浓度随日龄变化呈现上升趋势，同时说明粪便可能是空气中生物气溶胶的主要来源。空气中MRSA浓度与温度（P<0.01）、PM1浓度（P<0.05）、金黄色萄葡球菌浓度（P<0.01）呈显著正相关，其中PM1浓度与温度（P<0.05）、PM2.5浓度（P<0.01）呈显著正相关。该相关性结果表明，温度的变化会引起细颗粒物浓度的变化，从而引起所负载的MRSA浓度变化，导致空气中MRSA、金黄色萄葡球菌随蛋鸡日龄变化过程中所呈现的浓度变化与采样时温度变化相一致。值得注意的是，上述结果未发现空气中MRSA与粪便中MRSA的显著相关性，这可能和鸡场所处地理环境和养殖管理方式有关，也可能由于MRSA除了分布在粪便中还可存在于鸡的羽毛、皮肤和呼吸道中。空气中MRSA/LB比值与空气中MRSA浓度（P<0.05）呈显著正相关，而S/LB与MRSA/LB（P<0.05）呈显著正相关，二者比值变化趋势与MRSA浓度变化相类似。粪样中MRSA浓度变化与温度（P<0.05）为显著负相关，粪样中MRSA/LB与MRSA（P<0.05）为显著正相关。这可能是因为温度升高，加速粪便中MRSA逸散，空气中MRSA浓度相应升高。这导致了粪样中MRSA和MRSA/LB、MRSA/S比值有异于空气中相应变化。

图4 鸡舍内温度、湿度和颗粒物Figure 4 Temperature，humidity and concentration of particles in air of layer house

表2 鸡舍空气中MRSA影响因素Spearman相关性分析Table 2 Spearman correlation analysis of factors influencing methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）in air of layer house

本研究根据上述相关性分析结果作出初步回归分析，以此得到影响因素与MRSA、金黄色萄葡球菌和总细菌之间的量化关系。分析结果如表3所示。

由表3可知，当环境中其他变量保持稳定时，鸡舍内温度每升高1℃，空气中MRSA浓度平均升高49 CFU·m-3（R2=0.53）。同样条件下，日龄每增加1 d，空气中总细菌浓度平均升高110 CFU·m-3（R2=0.63）；粪样中总细菌浓度平均升高1.27×106CFU·m-3（R2=0.71），MRSA 浓度平均升高 434 CFU·m-3（R2=0.53），金黄色葡萄球菌浓度平均升高899 CFU·m-3（R2=0.94）。其中，粪样总细菌浓度每升高1 CFU·m-3，空气中总细菌浓度上升8.07×10-5CFU·m-3（R2=0.77）。

3 结论

本研究对蛋鸡场空气和粪便中MRSA、金黄色葡萄球菌和总细菌的浓度进行检测。实验结果表明，当蛋鸡在145~404 d日龄之间时，其舍内空气中总细菌、粪便中总细菌、MRSA和金黄色葡萄球菌浓度与日龄存在显著正相关。鸡舍空气中MRSA浓度随蛋鸡日龄增加而增加，与鸡舍内温度和细颗粒物呈显著正相关。整体上，MRSA/S较S/LB和MRSA/LB比值高，且空气中的MRSA/S比值略高于粪便中相应比值。本研究结果将为养鸡场空气中MRSA对工人以及对环境和居民的危害评估提供基础数据。

表3 鸡舍空气中MRSA影响因素回归分析Table 3 Regression analysis of factors influencing MRSA in air of layer house

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