丙泊酚对脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤后肢功能变化的影响

周亚净 刘建敏 魏淑明 张云豪 曲振华 陈树波

(河北医科大学附属邢台市人民医院麻醉科，河北 邢台 054001)

随着工业化程度的发展愈发迅速，人们脊髓损伤的临床发病率也呈现出上升的趋势，而脊髓损伤的预后一般较差，且具有很高的致残率。临床工作的难点在于如何最大程度修复脊髓损伤，以达到肢体功能康复的目的，提升患者的生存质量及生存率，减少死亡率〔1～3〕。丙泊酚临床应用多为全身麻醉的诱导和维持，但经过已进行的研究表明，其对神经系统的损伤也能起到一定保护作用〔4～6〕。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)作为干细胞中应用前景广泛的一类，经过一定条件的诱导，分化为不同的组织细胞，也有一定概率分化为神经元细胞，为治疗脊髓损伤展示了新的思路〔7～10〕。因此本研究将单独移植人UC-MSCs、单独应用丙泊酚及联合使用UC-MSCs和丙泊酚应用于脊髓损伤模型的治疗，观察其对脊髓损伤的作用及对肢体功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要试剂 在潍坊医学院附属益都中心医院其足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，70只成年雌性，体重200～250 g健康的SD大鼠〔许可证号SCXK(冀)20080010〕，购自河北省实验动物中心；L-DMEM培养基为美国GibcoBRL公司产品；从美国ThermoForma公司购买细胞培养箱，上海信然生物技术有限公司)提供的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，粉剂，pH7.2)；依地酸二钠钙(EDTA，天津市化学试剂一厂)；胰蛋白酶(GibcoBRL公司)；胎牛血清(FBS)(Hyclone公司产品)。CM-Dil、谷氨酞胺(美国Sigma公司)；从美国SantaCruz公司购买的辣根过氧化物酶(HRP)。

1.2UC-MSCs的培养及鉴定 经过伦理委员会的批准，本实验收集足月剖腹产胎儿的脐带组织若干，去除血管后，0.1%Ⅱ型胶原酶，剩余的间质组织切割成大约直径为1 mm3组织块，将处理好的组织块收集，胰酶(0.25%浓度)以2倍体积被加入予以充分消化30 min。离心后留存下来的细胞及组织，被接种于直径10 cm的培养皿中，加入DMEM培养基及5% FBS进行培养。首次传代后每3天按1∶3的比例传代，实行扩增培养。提取P3代细胞，消化后加人相应对照标记及PEFITC标记的CD73、CD105、CD31、KDR、CD34、VWF、CD45、HLA-DR、CD235a流式抗体，经流式细胞仪检测。

1.3CM-Dil标记UC-MSCs 提前将CM-Dil液用专用的稀释剂稀释，然后在1 ml DMEM培养基(含有5% FBS)中加入稀释过的CM-Dil液5 μl，此操作过程需要完全避光。将混合后的标记液加入上述UC-MSCs的培养皿中，浓度为40 μl/cm2，加入标记液后的UC-MSCs细胞(融合度达到80%以上)继续被放入恒温37℃培养样孵育20 min。标记过程结束后，将标记液吸出丢弃，用PBS清洗3次，加入完全培养基(DMEM 9.5 ml+0.5 ml FBS)清洗3次，再继续用上述完全培养基培养24 h。荧光显微镜被应用于观察UC-MSCs被CM-Dil标记的情况，吸取适量传代时制成的UC-MSCs单细胞悬液用以加入流式细胞仪，通过对细胞悬液的检测得出CM-Dil的标记率。

1.4动物模型的建立及分组 在正式实验前将所有SD大鼠制成脊髓损伤模型。所有大鼠从购买来后在实验室适应性饲养14 d，全部称重后将其麻醉，麻醉药物选用10%水合氯醛溶液，麻醉浓度为350 mg/kg，将大鼠以俯卧位固定四肢于操作台上，麻醉方式为腹腔注射给药。大鼠背部被完整备皮后，沿着脊柱逐层切开背部皮肤，完全暴露出T7～T10，硬膜保持完整的前提下去除部分T8～T9的棘突和椎板。接下来将10 g重物从2.5 cm高处落下砸击大鼠暴露出来的硬膜及脊髓组织(改良Allen法)〔11，12〕。缝合后待大鼠恢复意识后继续放回笼中饲养，造模成功的标志是大鼠出现双下肢瘫痪，相应运动功能评分为0，并伴随有尾巴痉挛摆动。造模成功64只SD大鼠，死亡6只，成功造模的SD大鼠被随机分为对照组、UC-MSCs组、丙泊酚组、联合组各16只。造模6 d后，对照组注射1 ml纯DMEM培养基，UC-MSCs移植组注射1 ml UC-MSCs细胞悬液(细胞数3×106个/L)，丙泊酚组利用尾部留置针连续4 h注射丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)，联合组的处理是在注射与UC-MSCs移植组相同剂量的细胞悬液后与丙泊酚组一起通过尾部留置针连续注射预制好的丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)。

1.5下肢运动功能评价 应用斜板试验、Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分〔13～16〕，造模前1 d及造模后1、3 d、1、2、3、4 w，一共测评6次，每次评价均从上午8：00开始，由两人合评后取平均分。

1.6HE及荧光显微镜观察 随机从每组中选取5只造模4 w的脊髓损伤模型大鼠，麻醉方式与上述一致，然后暴露出所选择出的所有模型SD大鼠脊髓损伤的部位，约1 cm脊髓损伤区域的组织被分别取出，加入提前预制好4%的甲醛予以充分固定，固定好后将其用石蜡包埋并制作成切片，分别被用于HE染色和免疫组织化学。将切片进行二甲苯脱蜡处理，然后予以从高到低的乙醇水合，2 min的水洗后再加以苏木素予以充分染色5 min，再次水洗后加入盐酸乙醇分化，弱氨水反蓝后水洗再将伊红染液应用于切片染色15 min。再次通过梯度乙醇溶液脱水处理，加入二甲苯使其透明，封片时采用中性树脂。光学显微镜被应用于脊髓损伤的情况，CM-Dil标记的阳性细胞数则是使用荧光显微镜观察。

1.7体感诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)的检测 再次随机从各组抽出5只模型大鼠，分别于造模后及伤后4 w予以10%水合氯醛将其麻醉后固定四肢，检测其MEP和SEP〔17〕。SEP将电极放于头皮下后肢皮层感觉区后方约0.5 cm处，给予电流刺激(直流方波)，频率为3 Hz，波宽为0.2 ms，强度为5～15 mA叠加次数为50～60次。MEP：将电极放置于大脑皮质运动区，强度为40 mA，波宽为0.1 ms，频率为1 Hz，扫描速度为5 ms/D，叠加次数为300～500次，灵敏度为5 μV/D。对电流刺激后的幅度和相应诱发电位潜伏期被详细记录。

1.8HRP逆行神经示踪 随机从各组抽出5只模型大鼠，麻醉后部分暴露脊椎，注射用生理盐水溶解HRP。采用留置针进针，溶解后的HRP溶液以0.1 μl/10 min的速度注射，注射1 μl HRP完毕后，继续留针15 min再拔针。做好相应标记，继续将本次抽选的所有SD大鼠放回笼中饲养3 d。3 d后将注射过HRP的大鼠取出麻醉后留取脊髓组织予以冰冻切片，再应用二氨基联苯胺(DAB)加强染色法。每组随机抽取10张切片，对切片上HRP阳性神经纤维束进行计数。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1UC-MSCs形态学观察 UC-MSCs接种到培养皿并加入含有5% FBS的培养基第4天，细胞贴壁数显著增多，贴壁在皿底的细胞形态大部分呈现出单一的长梭形，部分形成集落。培养至第9天时，培养皿底部细胞融合度达到90%以上，出现旋涡状细胞集落。流式细胞仪被应用于UC-MSCs细胞标记率的检测，结果显示CD90(90.7%)，CD49(84.9%)，CD29(99.4%)，CD105(92.2%)阳性，被CM-Dil标记后的细胞标记率达100%。荧光显微镜观察下培养皿中的UC-MSCs，镜下可见标记后的UC-MSCs呈现出红色荧光，见图1。

2.2下肢运动功能评价结果 造模前4组SD大鼠的斜板试验、BBB评分差异无统计学意义(P>0.05)，造模后2～4 w，与对照组比较，丙泊酚组、UC-MSCs组及联合组的评分均更高，其中联合组分数最高(P<0.05)，见表1。

2.3HE染色和荧光显微镜观察 通过对HE染色后的大鼠脊髓组织切片进行观察，对照组可见明显的脊髓损伤空洞，而其他组脊髓空洞明显减小，其中联合组空洞面积最小，见图2。通过荧光显微镜观察注射经CM-Dil标记后的UC-MSCs组脊髓切片，可见散在红色荧光，且联合组被荧光标记细胞数更多，见图3。

图1 第3代UC-MSCs形态学观察(×200)

表1 各时间点BBB评分、斜板试验、改良Tarlov评分

与同时点对照组比较：1)P<0.05

对照组

丙泊酚组

UC-MSCs组

联合组

对照组

丙泊酚组

UC-MSCs组

联合组

2.4SEP和MEP的检测结果 脊髓损伤模型建立后，治疗各组大鼠SEP、MEP均未被检测到，伤后4 w，MEP、SEP均有不同程度恢复(P<0.05,P<0.01)，对照组轻微恢复电位，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，表3。

表2 伤后4 w各组SEP检测

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.5HRP逆行神经示踪 HRP注射后经逆行运输，观察4组脊髓损伤模型大鼠的脊髓切片可见T8以上节段有被HRP标记的神经纤维。见图4。对照组可见少量的神经纤维(14.24±3.51)个/高倍视野，另外经过治疗的三组神经纤维数目都较之明显升高，尽管丙泊酚组及UC-MSCs组〔(21.52±4.40，20.38±3.84)个/高倍视野〕比对照组明显增高，但对比联合组明显减低〔(31.21±5.40)个/高倍视野，P<0.01〕。

表3 伤后4 w各组MEP检测

对照组

UC-MSCs组

联合组

丙泊酚组

3 讨 论

脊髓损伤的发病率上升趋势越发明显，其原因与社会工业化程度的日益加深及经济高速发展有着密切的联系〔18，19〕。脊髓一旦发生损害，患者的生活质量及疾病预后都十分不乐观，因其损伤后的脊髓不能自我修复、再生，从而随着损伤后继发的一系列神经系统病理变化，可能会对病人造成永久性的神经损伤，导致极高的致残率及死亡率。急性脊髓损伤所导致的一过性损伤，大量的自由基在损伤区域产生，介导之后的一系列氧化反应，同时自由基、细胞因子等触发细胞凋亡，引起很多继发性的病理变化，导致损伤区域的神经系统功能缺失〔16，20～23〕。

临床上现有的针对脊髓损伤的治疗方法，多是通过对营养神经药物的应用，从而维持脊髓神经系统的现有功能，同时配合一定的肢体康健治疗，促进濒临坏死的神经元的功能恢复〔24，25〕。但是，脊髓神经细胞本身已经不具有自我修复及再生的功能，现有的常用治疗手段只能使肢体功能部分恢复，不能达到损伤前水平，甚至导致肢体致残后，不仅影响患者生活质量，更对患者心理有不良作用。如何使脊髓神经细胞在体外诱导分化成为遗传稳定的组织细胞干细胞是研究者关注中心〔26，27〕。UC-MSCs是一类存在于新生儿脐带组织中的干细胞，是其他细胞的“种子”，具有强大的分化能力，并且也有一定的迁移能力，可以成为骨髓神经元的良好供体。UC-MSCs移植进脊髓损伤的机体后，通过释放趋化因子迁移进入损伤区域，分化成为所需要补充的细胞，同时降低炎性反应，从而使得脊髓组织重构，恢复神经系统功能〔28，29〕。

本文结果显示，丙泊酚对损伤的脊髓神经组织具有保护作用，丙泊酚联合UC-MSCs移植治疗脊髓大鼠损伤，使得神经元再生，对下肢的神经生理功能有着极大的改善，运动功能恢复良好，有助于日后临床工作中成为治疗方法的另一种选择。

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