五味子乙素对脂多糖诱导的心肌H9c2细胞炎性损伤的影响及其作用机制研究

王玲，王凤萍

五味子乙素（Schisandrin B）是从中草药五味子中提取的脂素类物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及参与免疫调节等作用［1］。研究表明，五味子乙素可通过增强抗氧化系统功能而减轻肝损伤［2-3］，通过清除自由基而减轻心肌缺血/再灌注损伤及脑损伤等［4-5］。急性心肌梗死是临床常见心血管疾病之一，可导致心肌缺血缺氧损伤及心肌重塑，引发心肌细胞凋亡、炎症、坏死［6］，而心肌细胞凋亡、炎症可造成急性心肌梗死进一步加重并引发心肌功能障碍、心力衰竭等，导致患者死亡风险升高［7］。胡开永等［8］研究表明，五味子乙素对阿霉素诱导的心脏毒性具有一定保护作用，但五味子乙素减轻心肌细胞炎性损伤的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨五味子乙素对脂多糖（LPS）诱导的心肌H9c2细胞炎性损伤的影响及其作用机制，以期为五味子乙素的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 心肌H9c2细胞（购自杭州赫贝科技有限公司），五味子乙素（北京索莱宝科技有限公司生产，生产批号：65205-64-2），胎牛血清（FBS）（Gibco公司生产，生产批号：SR01C-657）；DMEM完全培养基（Invitrogen 公司生产，生产批号：20171009），八肽胆囊收缩素（CCK8）试剂盒（江苏科晶生物科技有限公司生产，生产批号：WST-8），磷脂酰丝氨酸蛋白抗体/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡试剂盒（江苏凯基生物科技有限公司生产，生产批号：KGA106）；白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒均购自江苏科晶生物科技有限公司，生产批号分别为MT1628、MT5416；RIPA裂解液（杭州碧云天公司生产，生产批号：HBS0637），二辛酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（杭州碧云天公司生产，生产批号：P1527），增强型化学发光试剂（ECL）（上海翊圣生物科技有限公司生产，生产批号：P00018）；β-actin（生产批号：abs103627）、PI3K（生产批号：abs256107）、Akt（生产批号：abs021054）、p-Akt（生产批号：abs120584）、FoxO1（生产批号：abs201352）、p-FoxO1（生产批号：abs003266）一抗均购自英国Abcam公司，二抗羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美国LI-COR Biosciences公司生产，生产批号：HS20171106）。

1.2 仪器及设备 BBS-V800单人超净台（济南鑫贝西生物技术有限公司生产），HERAcell 2401细胞培养箱（美国Thermo公司生产），HBS-1096A酶标仪（上海京工实业有限公司生产），Attune NxT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific 公司生产），GenoSens 1850 凝胶成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司生产）。

1.3 心肌H9c2细胞培养方法 2017 年3月—2018年1月，采用包含10% FBS、1%双抗溶液的DMEM完全培养基，将心肌H9c2细胞置于5% CO2、37 ℃恒温HERAcell 2401细胞培养箱中贴壁培养，待心肌H9c2细胞生长至90%左右时培养瓶消毒后置于BBS-V800单人超净台，弃去旧培养基，加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍后加入胰酶消化，显微镜下观察心肌H9c2细胞变圆后加入培养基终止消化，离心后弃去旧培养基并加入新鲜培养基吹打心肌H9c2细胞，按1:3比例进行传代培养。

1.4 分组方法 五味子乙素对心肌H9c2细胞的毒性试验结果表明，150 mg/L五味子乙素对心肌H9c2细胞无明显毒性，且采用10、50、150 mg/L浓度梯度的五味子乙素对H9c2细胞进行试验有望得到最佳结果，因此本实验将传代培养的心肌H9c2细胞接种于96孔板上并分为正常对照组（A组）、LPS诱导组（B组）、LPS+低剂量五味子乙素组（C组）、LPS+中剂量五味子乙素组（D组）、LPS+高剂量五味子乙素组（E组），细胞生长贴壁后A组心肌H9c2细胞常规培养，B组心肌H9c2细胞仅加入含1 mg/L的LPS，C、D、E组心肌H9c2细胞在B组基础上分别加入10、50、150 mg/L五味子乙素，后共同置于 5% CO2、37 ℃恒温 HERAcell 2401细胞培养箱培养24 h。

1.5 观察指标

1.5.1 细胞相对存活率 5组心肌H9c2细胞经处理后弃去旧培养基，每孔加入10 μl CCK8试剂，置于HERAcell 2401细胞培养箱中继续培养1 h，采用HBS-1096A酶标仪测定心肌H9c2细胞吸光度OD值并计算细胞相对存活率。

1.5.2 细胞凋亡率 5组心肌H9c2细胞经处理后加入1 μl Annexin-FITC 混匀，后加入 5 μl PI混匀，避光反应5 min，采用Attune NxT流式细胞仪检测心肌H9c2细胞凋亡率，第2、4象限心肌H9c2细胞百分比即为心肌H9c2细胞凋亡率。

1.5.3 炎性因子含量 5组心肌H9c2细胞经处理后收集上清液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-6、TNF-α含量，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.5.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋 白 相 对表达量 5组心肌H9c2细胞处理后每孔加入200 μl RIPA裂解液并置于冰上充分裂解30 min，以β-actin为参照，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒、免疫印迹法（Western Blot）法检测并计算心肌H9c2细胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相对表达量。每孔加入50 μg心肌H9c2细胞进行凝胶电泳：275 mA恒流下转膜90 min，5%脱脂牛奶封闭条带1 h，一抗孵育：PI3K（稀释浓度为1:1 000），Akt（稀释浓度为1:1 000），p-Ak（t稀释浓度为1:1 000），FoxO1（稀释比浓度为1:1 000），p-FoxO1（稀释浓度为1:1 000）；4 ℃摇床上缓慢振摇过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液-吐温20（TBST）洗膜3次，8 min/次，后将条带置入二抗羊抗兔IgG溶液（稀释浓度为1:3 000），常温摇床上缓慢振摇1 h，ECL显色后采用GenoSens 1850凝胶成像仪显影，采用Image J软件进行半定量分析，凝胶电泳结果见图1。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 心肌 H9c2细胞 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白电泳图Figure 1 Protein electrophoresis of PI3K，Akt，p-Akt，FoxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells

2 结果

2.1 细胞相对存活率 以A组为参照（100%），B、C、D、E组心肌H9c2细胞相对存活率分别为（49.3±5.8）%、（58.6±6.7）%、（67.4±5.9）%、（81.3±7.4）%，差异有统计学意义（F=8.32，P＜0.05）；C、D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于B组，D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于C组，E组心肌H9c2细胞相对存活率高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 细胞凋亡率 A、B、C、D、E组心肌H9c2细胞凋 亡 率 分 别 为（4.6±1.4）%、（46.5±7.6）%、（37.1±5.4）%、（28.4±4.8）%、（19.5±2.7）%，差异有统计学意义（F=6.17，P＜0.05）；B、C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率高于A组，C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率低于B组，D、E组心肌H9c2细胞凋亡率低于C组，E组心肌H9c2细胞凋亡率低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 炎性因子含量 5组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B、C、D、E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量高于A组，C、D、E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于B组，D、E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于C组，E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋白相对表达量 5组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而5组心肌H9c2细胞Akt、FoxO1蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B、C、D组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量低于A组，C、D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于B组，D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于C组，E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 5组心肌H9c2细胞炎性因子含量比较（，ng/L）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

表1 5组心肌H9c2细胞炎性因子含量比较（，ng/L）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

注：IL-6=白介素6，TNF-α=肿瘤坏死因子α；与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05；与D组比较，dP＜0.05

组别 IL-6 TNF-α A 组 536.3±114.5 84.5±12.6 B 组 1 754.6±294.6a 195.6±26.8a C 组 1 453.5±238.5ab 152.3±23.7ab D 组 1 054.2±204.2abc 120.4±16.5abc E组 687.7±128.1abcd 90.2±14.6abcd F值 16.305 10.329 P值 ＜0.05 ＜0.05

表2 5组心肌H9c2细胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相对表达量比较（x± s）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of PI3K，Akt，p-Akt，FoxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells in the five groups

3 讨论

大量临床研究表明，急性心肌梗死患者体内炎性因子表达水平尤其是梗死心肌IL-6、TNF-α表达水平明显升高，而IL-6、TNF-α表达水平升高可进一步导致心肌功能紊乱及心肌细胞凋亡、坏死［9］。炎性反应是包括心肌细胞在内的多种细胞凋亡、坏死的重要病理改变，降低细胞炎性因子含量有助于减轻细胞损伤。本研究结果显示，C、D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于B组，D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于C组，E组心肌H9c2细胞相对存活率高于D组，表明五味子乙素可有效促进LPS诱导的心肌H9c2细胞增殖，且心肌H9c2细胞相对存活率随着五味子乙素剂量增大而升高，表现出剂量依赖性；B 、C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量高于A组，C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于B组，D、E组心肌H9c2细胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于C组，E组心肌H9c2细胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于D组，表明五味子乙素可有效抑制LPS诱导的心肌H9c2细胞凋亡并降低炎性因子含量，且心肌H9c2细胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量随着五味子乙素剂量增大而降低，亦表现出剂量依赖性。

PI3K/Akt是细胞内重要的信号传导通路，Akt磷酸 化 为 p-Akt可 引 起 Caspase-3、Caspase-9、Bax的Ser184位点磷酸化而降低凋亡蛋白活性并上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，进而抑制细胞凋亡；此外，PI3K/Akt信号通路还可调控FoxO1磷酸化并导致其从胞核内移出至胞质，继而抑制转录因子与DNA结合及细胞凋亡［10-11］。动物实验结果表明，PI3K/Akt/FoxO1信号通路的激活有利于减轻心肌细胞损伤，而过氧化物酶增殖物激活受体α（PPAR-α）可通过激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路负性调控心肌细胞肥大［12］。郭进建等［13］研究发现，康心饮可诱导缺血性心肌病大鼠心肌细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表达量升高并激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路，诱导促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达下调及抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，从而抑制心肌细胞凋亡。本研究结果显示，B、C、D组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量低于A组，C、D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于B组，D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于C组，E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于D组，表明五味子乙素可有效上调LPS诱导的心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白的表达，激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路，且PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表达量随着五味子乙素剂量增大而升高，表现出剂量依赖性，与上述研究结果一致。

综上所述，五味子乙素可有效促进LPS诱导的心肌H9c2细胞增殖、抑制心肌H9c2细胞凋亡、降低心肌H9c2细胞炎性因子含量，有利于减轻细胞炎性损伤，其作用机制可能与激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路有关；本实验结果对临床采用五味子乙素辅助治疗心肌炎等心肌损伤性疾病具有一定参考价值，但本实验仅为体外细胞学研究，尚缺乏动物学实验结果支撑，结果结论仍需在今后的研究中进一步证实。

作者贡献：王玲进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，监督管理；王凤萍进行数据收集、整理及统计学处理，进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校；王玲、王凤萍进行结果的分析与解释，负责撰写论文。

本文无利益冲突。