ABCB1基因C3435T 位点多态性与新疆维吾尔族人群癫痫及耐药性的关系研究

高华，陈明，裴静，陈方方，潘燕，孔祥锋

癫痫是一种神经系统慢性疾病，具有较高的猝死风险，其主要病理机制为脑内神经元异常放电导致脑功能短暂性障碍［1］。据流行病学统计显示，全球约有7 000万例癫痫患者，以中低收入国家为主，儿童、青少年多见［2-3］。在我国，癫痫患者有900万例左右，且每年有1‰～2‰的患者因癫痫猝死［4-5］。目前癫痫的治疗仍以药物治疗为主，大部分患者服用抗癫痫药物后效果良好，但仍有20%～30%的患者对抗癫痫药物不敏感［6］，被称为耐药性癫痫［7］。耐药性癫痫不仅损伤患者中枢神经系统的功能和结构，增加患者骨折或骨质疏松发生风险，长期癫痫还会引起患者精神心理问题，如焦虑、抑郁、认知功能下降等，在一定程度上增加患者自杀、意外事故死亡风险［8］。

有研究显示，遗传基因多态性可能参与抗癫痫药物进入机体后的反应过程［7］。ABCB1基因（也称为多药耐药蛋白1）编码的膜转运体蛋白可对抗癫痫药物在体内分布以及肠内吸收过程产生一定影响，P糖蛋白（P-gp）是第1个被发现的人类ABCB蛋白［9-11］，其水平变化与ABCB1基因C3435T位点多态性有关［12］。新疆地区民族分布具有一定特点，形成了与地域、民族相关的疾病，本研究旨在探讨ABCB1基因C3435T位点多态性与新疆维吾尔族人群癫痫及耐药性的关系，为新疆维吾尔族癫痫患者的治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：（1）年龄 ＞ 14岁；（2）至少有2次间隔24 h以上、发作明确的非诱发性癫痫样发作；（3）行脑电图（EEG）、颅脑CT或核磁共振成像（MRI）检查排除进行性中枢神经系统疾病和占位性病变者。排除标准：（1）有癫痫或高热惊厥病史；（2）无癫痫家族史。

1.2 研究对象 选取2017年新疆医科大学第五附属医院收治的住院或门诊维吾尔族癫痫患者98例作为癫痫组，其中耐药性癫痫患者38例，非耐药性癫痫患者60例，耐药性癫痫的诊断参照2010年国际抗癫痫联盟制定的耐药性癫痫诊断标准［13］；另选取同期在本院体检健康的维吾尔族志愿者100例作为对照组。癫痫组患者中男50例，女48例；年龄18～77岁，平均年龄（41.3±12.8）岁。对照组受试者中男50例，女50例；年龄2～67岁，平均年龄（45.8±10.1）岁。对照组与癫痫组受试者性别（χ2=0.021）、年龄（t=3.368）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。耐药性癫痫患者中男20例，女18例；年龄19～75岁，平均年龄（43.3±15.1）岁。非耐药性癫痫患者中男32例，女28例；年龄18～77岁，平均年龄（40.0±11.0）岁。耐药性癫痫与非耐药性癫痫患者性别（χ2=0.064）、年龄（t=2.683）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经新疆医科大学第五附属医院医学伦理委员会审核通过，所有受试者签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取两组受试者外周静脉血2 ml，采用天根生化科技（北京）有限公司DNA提取试剂盒（天根基离心柱型）进行DNA的提取，严格按照说明书进行操作。

1.3.2 基因多态性检测 （1）引物设计：ABCB1基因C3435T位点的引物设计由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ABCB1基因C3435T位点的引物序列为 F：5'-GTTTTCAGCTGCTTGATGGCA-3'，R：5'-AAGGGTGTGATTTGGTTGCT-3'。（2）聚合酶链式反应（PCR）体系：样本 DNA 2 μl，dNTP 200 μmol，MgCl21.5 mmol， 上 下 游 引 物 各 1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 U，ddH2O 8.5 μl，终体积为 25 μl。（3）PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 35 s，53 ℃退火 35 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；最后 72 ℃延伸10 min。（4）选取5 μl PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中180 V，电泳15 min观察条带。（4）选取10 μl PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行直接测序并与ABCB1基因C3435T位点的基因标准序列进行比对。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。遗传平衡检验采用Hardy-Weinberg平衡检验；计量资料以（x± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2值分别为3.111、1.601；P值分别为0.078、0.996）。

2.2 PCR扩增产物及直接测序分析 ABCB1基因C3435T位点的PCR扩增产物与理论值基本一致，见图1。癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点经直接测序后均存在CC、CT、TT 3种基因分型。

2.3 癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点的基因型和等位基因分布频率 癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点的基因型、等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 癫痫组与对照组受试者ABCB1基因C3435T位点基因型和等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 1 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus between epilepsy group and control group

图1 ABCB1基因C3435T位点PCR扩增产物电泳图Figure 1 The electrophoresis of PCR product of ABCB1 C3435T

2.4 耐药性癫痫与非耐药性癫痫患者ABCB1基因C3435T位点基因型和等位基因分布频率 耐药性癫痫与非耐药性癫痫患者ABCB1基因C3435T位点基因型、等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表2 耐药性癫痫与非耐药性癫痫患者ABCB1基因C3435T位点基因型和等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus in patients with drug-resistant epilepsy or not

3 讨论

癫痫是常见的神经系统疾病，以药物治疗为主，但患者对抗癫痫药物（包括卡马西平、丙戊酸、苯巴比妥等）耐药是影响药物治疗效果的主要原因之一。有研究显示，癫痫患者耐药可增加癫痫发作次数、相关并发症和死亡风险［14-15］。目前，耐药癫痫的发病机制尚不清楚，主要学说为转运体假说和靶点假说［16-17］。

既往研究表明，P-gp水平及其功能均受到ABCB1基因多态性的影响［17-18］。P-gp可将细胞内部分代谢产物和部分药物分子逆向转运出细胞，导致细胞内药物浓度降低。卡马西平、苯妥英钠等抗癫痫药物均可作为P-gp底物，促进其水平升高［19］，进而影响药物吸收。基于ABCB1基因C3435T位点与P-gp相关、脑内P-gp过量表达可促进抗癫痫药物的排出及ABCB1基因被证实与部分药物（如地高辛［20］、环孢素［21］和非索那定［22］）药代动力学存在交互作用，推测基因多态性可能是产生癫痫耐药的重要机制之一［23］。遗传学研究结果显示，ABCB1基因中常见遗传变异与癫痫的耐药性相关，尤其是C3435T（rs1045642）位点多态性备受关注［24-25］。单核苷酸C3435T同义突变指外显子26的3435位点上C转化为T，其与P-gp水平及药物反应相关［26］。近年有关ABCB1基因C3435T位点多态性与耐药性癫痫的相关性研究报道较多，但研究结果并不一致［27-29］。分析上述研究结果不一致的原因可能与选取的研究对象不同和疾病进展或患者自身因素导致抗癫痫药物进入减少或耐受性增加有关［30-31］。

新疆是维吾尔族人群主要聚集地，其民俗保持了较好的同质性，且多为同民族间联姻，遗传稳定性较好，故本研究选取新疆维吾尔族人群为研究对象，结果显示，癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点经直接测序后均存在CC、CT、TT 3种基因分型，与既往国内外关于癫痫基因分型研究的结果一致［24］。本研究结果还显示，癫痫组和对照组受试者ABCB1基因C3435T位点基因型、等位基因分布频率间无差异，耐药性癫痫与非耐药性癫痫患者ABCB1基因C3435T位点基因型、等位基因分布频率比较无统计学差异，提示ABCB1基因C3435T位点多态性与新疆维吾尔族人群癫痫易感性及耐药性癫痫的发生无关，与既往部分研究结果相一致［27］。

综上所述，ABCB1基因C3435T位点多态性与新疆维吾尔族人群癫痫易感性及耐药性癫痫的发生无关。

作者贡献：孔祥锋进行试验设计；高华进行试验实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；陈明、裴静、陈方方进行试验实施、评估、资料收集；潘燕进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。