盐穗木根际土壤产ACC脱氨酶细菌的筛选与鉴定

张 盼，王伟楠，樊永红

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】过度使用化肥、不合理的灌溉和植被大量的遭到破坏，盐碱地每年都有增长的趋势[1]。由于新疆特殊的地理和气候条件，盐碱地面积大[2]，可耕地的次生盐碱化程度越来越高。在新疆，盐穗木 (Halostachyscaspica) 一般生长在荒漠地区的盐碱地[3]，它属于藜科 (Chenopodiaceae) 盐穗木属半灌木盐生植物，它是盐碱地优势种[4]。具有ACC脱氨酶活性的植物根际促生菌可以在重金属污染、盐胁迫或干旱等逆环境下提高植物的抗逆性，促进植物的生长。从盐穗木根际土壤中筛选出的产ACC脱氨酶活性较高菌株，为研究产ACC脱氨酶的关键基因提供原材料，为PGPR促进植物生长提供一定的前期基础。这对于改良新疆的盐碱地等地区的生态环境的修复具有重要的意义。【前人研究进展】植物根际的土壤中存在一些细菌，这类细菌可以调节或促进植物生长发育，这些细菌被称为植物根际促生细菌( plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR )，研究表明，PGPR能合成植物的某些生长激素或酶等调节和促进植物的生长[5]。植物根际促生细菌还能够通过固氮、解磷和解钾等特性改变土壤的理化性质，增加植物根系的吸收能力，提高植物对养分的吸收率,也能抑制土地中农作物致病菌的生长，并可以产生促进植物生长的一些重要激素[5]。PGPR还可以间接的分泌部分离子载体和产生抗逆性物质等方式切断和终止植物致病菌对植物产生的负影响，通过产生植物激素，酶降解来减少乙烯含量水平等方式刺激与调节植物的生长。Glick等[6]研究发现细菌中能具有产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶活性(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，简称为ACC脱氨酶)功能的菌株分泌的ACC脱氨酶可以将植物体内过量的乙烯的直接前体ACC分解为a-丁酮酸和氨，降低乙烯的含量，调节或促进植物正常生长。植物在逆环境下受到胁迫时，根系处乙烯代谢会显著性增强，而乙烯含量异常增加会抑制植物正常的生理生长，如加快叶片成熟、衰老和死亡，降低叶片光合作用，从而降低作物产量，并且会阻碍植株在胁迫因子消除后的复原[7-9]。【本研究切入点】在新疆，盐穗木 (Halostachyscaspica) 一般生长在荒漠地区的盐碱地[8]，它属于藜科 (Chenopodiaceae) 盐穗木属的半灌木盐生植物，它是盐碱地的优势种[9]，采用筛选培养基定向富集的方法，目的是筛选到产ACC脱氨酶活性菌株。从其的根际土壤中筛选出的产ACC脱氨酶活性较高的菌株，为研究产ACC脱氨酶的关键基因提供原材料，以及为后续PGPR促进植物生长提供一定的前期基础。这对于改良新疆的盐碱地等地区的生态环境的修复具有重要的意义。【拟解决的关键问题】从新疆盐穗木的根际土壤中筛选到产ACC脱氨酶活性较高的菌株，对其进行扫描电镜的形态学观察；革兰氏染色、芽孢染色，硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用等部分生理生化试验，使用Biolog Gen III微孔板鉴定和16S rDNA序列同源性分析对分离的菌株进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 盐穗木

供试土样采集于新疆五家渠荒漠盐碱地的盐穗木根际的土壤，土壤样品储存在-20℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂

TSB液体培养基、TSB固体培养基、PAF培养基、LB培养基、DF培养基、ADF培养基，参照Penrose和张国壮等方法[10-11]。

1.1.3 主要仪器设备

Biolog自动微生物鉴定系统、电动移液器、浊度仪(Gen III MicroStation，美国Biolog公司)；台式高速冷冻离心机(Neofuge 13R 德国)；显微镜(CX21FS1，OLYMPUS)；超净工作台(SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术有限公司)；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅(XXQ-SG46-28OS 上海搏迅安业有限公司)；恒温培养箱(PYX-DHS-50×65 上海跃进医疗器械一厂)。

1.2 方 法

1.2.1 产ACC脱氨酶菌株的分离与筛选

采距离盐穗木根系1～2 cm处的土壤，过60目筛 ，去除树根等杂质，即得到根际土壤。分离筛选菌株的方法参照张国壮等[11]的方法进行。称量2 g盐穗木根系的土壤置于100 mL 无菌的PAF 液体培养基中，在 30℃ 、150 r/min条件下振荡24 h；吸取2 mL 的菌悬液加入PAF 液体培养基，在 30℃ 、150 r/min条件下重复培养24 h，目的是使细菌富集。取2 mL富集培养液加入到100 mL的无菌DF液体培养基，在30℃ 、150 r/min条件下振荡培养24 h后再转接培养一次；取上述转接培养液2～100 mL无菌的含有3.0 mmoL/L ACC的液体 ADF培养基，在 30℃、150 r/min条件下重复筛选培养36 h后,梯度稀释培养液，用无菌的玻璃涂布棒涂布于固体的ADF(加有3.0 mmoL/L ACC)培养基，长出菌落后，反复在固体的ADF培养基上分离纯化，将纯化后无杂菌的单菌落在TSB固体培养基的斜面上保存，并将含体积分数为15% 的甘油菌悬液放置于-20℃冰箱备用[12]。

1.2.2 ACC脱氨酶活性测定

参照Penrose和Glick等[10]的方法测定ACC脱氨酶的活性，ACC脱氨酶的单位酶活是指单位时间内ACC脱氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的物质的量(μmoL)，即为一个单位酶活力(U)。以牛血清蛋白为标准蛋白，采用Bradford比色法测定蛋白质的含量[13]，每次试验重复3次。

1.2.3 产ACC脱氨酶活性菌株鉴定

1.2.3.1 生长量

将筛选到的活性菌株的菌悬液按体积为1%比例加入灭菌的TSB液体培养基中，在 30℃ 、150 r/min条件下培养24 h后测其生长量，生长量测定的方法采用吸光度比浊法，以无菌水为对照，在OD600测定[14]。

1.2.3.2 形态学的观察、部分生理生化特征

将筛选分离的活性较高的菌株进行菌落形态学的观察，生理生化的试验，方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《微生物学实验》[16]中与细菌相关的生理生化测定部分。

1.2.4 Biolog Gen III 微孔板鉴定

Biolog微生物的自动鉴定系统 Gen III 板能对微生物进行94种表型的测试，包含：71种碳源利用的测试及23种化学敏感性的测试。测试的依据是根据四唑类氧化还原染料的色度变化来指示微生物对碳源的利用程度和对化学物质的敏感程度。在测试板上微生物所显示出的特定的“表型指纹”被用来在种水平上进行鉴定[17-21]。

1.2.5 16S rDNA序列测定与系统发育分

菌株分离纯化后保存在TSB固体斜面上，放于-20℃冰盒中送往上海生物工程公司完成16S rDNA序列的测定。在GenBank数据库中找到相似性最高的相关菌株的16S rDNA基因序列，进行Blast对比分析。采用MEGA6.0软件中的邻接法[22-24]。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

研究表明，1#、3#和5#菌株生存的土壤环境偏碱性，土样A比土样B的pH值要高出0.6；碳酸根离子含量 (g/kg)，重碳酸根离子(g/kg)，土样A分别是土样B的4倍和1.1倍；但是全盐量(g/kg)，钠离子(g/kg)，氯离子(g/kg)，钙离子(g/kg)，镁离子(g/kg)，硫酸根离子(%)土样B分别是土样A的2.10、1.78、2.65、11.17、5.29和2.29倍。5#菌株的生长所需要的各离子含量要比1# 和3# 菌株的生长所需要含量多。表1

表1 土壤理化性质
Table 1 Physical and chemical properties of soil

检测项目Test itemsAB检测项目Test itemsABpH值 pH value9.208.60 重碳酸根离子(g/kg)0.210.19全盐量 Total salt (g/kg)16.2034.10钙离子(g/kg)0.060.67钠离子 Sodium ion (g/kg)4.528.06镁离子(g/kg)0.422.22氯离子 Chloride ion (g/kg)4.9013.00硫酸根离子(%)0.491.12碳酸根离子 Carbonate ion (g / kg)0.240.06

2.2 产ACC脱氨酶菌株的筛选及其ACC脱氨酶活性

经过多次富集、分离纯化，筛选三株具有ACC脱氨酶活性的菌株，编号为1#、3#、5#。分别取三株菌株2 mL的菌液加到无菌的TSB液体培养基中培养，在OD600测其生长量的变化，三株菌株培养2～6 h时，细菌快速的进入对数期，随着培养时间的增加OD600缓慢的变化，在10 h后菌株缓慢的进入稳定期。图1

图1 三株菌株生长曲线

Fig.1Growthcurveofthreestrains

经测定计算三株菌株的ACC脱氨酶的酶活力分别为0.186 1、0.176 3、0.249 0 μmoL，GraphPadPrism 5.0分析1# 与3# 之间酶活力差异不显著，1# 与5#；3# 与5# 之间酶活力差异显著 (P<0.05)，1#与3#之间酶活力差异不显著，经计算1#、3#和5# 的酶比活力为0.012、0.012、0.014 U/mg。图2

图2 三株菌株酶活力
Fig.2 Enzyme activity of three strains

2.3 产ACC脱氨酶菌种鉴定

2.3.1 形态学的观察、生理生化特征

三株菌株在ADF固体培养基上菌落形态均为圆形凸起，表面湿润光滑，有光泽，边缘整齐；1# 和3# 菌株菌落颜色为淡黄色，不透明的；5# 菌株菌落颜色为无色的，透明的。三株菌株均有芽孢，革兰氏染色为阴性。硝酸盐还原为阳性，能利用柠檬酸盐。扫描电镜图中可以清晰的看到三株菌株均为短杆菌。表2，图3，图4

表2 三株产ACC脱氨酶细菌主要生理生化特征
Table 2 Main physiological and biochemical characteristics of three strains of ACC deaminase producing bacteria

测试项目Test items菌株 Strains1#3#5#测试项目Test items菌株 Strains1#3#5#柠檬酸盐利用 Citric acid salt+++油脂水解---淀粉水解 Hydrolysis of starch+++甲基红实验---明胶液化 Gelatin liquefaction+++葡萄糖发酵+++淀粉水解 Aqueous solution+++蔗糖发酵+++石蕊牛奶 Lime cow milk+++乳糖发酵+++

注：“+”阳 性；-；阴 性

Note: "+" positive;-;negative

图3 三株菌株菌落
Fig.3 Colony pictures of three strains

图4 三株菌株的扫描电镜

Fig.4Scanningelectronmicrographofthreestrains

2.3.2 Biolog法鉴定

菌株用专用的Biolog培养基培养1～2代后，在Biolog GenⅢ板微孔培养4～36 h后，用Biolog细菌鉴定系统进行快速的分析，用可能性(probability, PROB)、相似性(similarity, SIM)和距离 (distance, DIS) 三个参数来判断鉴定结果，并在ID地址栏中显示到最佳的匹配名称。

研究表明，1#、3#和5# 在ID地址栏显示出最佳的匹配名称分别是Klebsiellapneumoniae，Klebsiellaoxytoca，Klebsiellaoxytoca。1#，PROB=0.503，SIM=0.503>0.5；

3#，PROB=0.596，SIM=0.596> 0.5；5#，PROB=0.939，SIM=0.689> 0.5。观察三株菌株的代谢指纹图谱，发现三株菌株在GEN III 微孔板上对71不同碳源的利用情况是有所不同的，代谢指纹图谱相应的也表现出明显的差异。图5

图5 三株菌株在 Gen III板鉴定
Fig.5 Identification results of three strains in Gen III plates

2.3.3 16S rDNA基因测序的分析和系统发育树的构建

根据16S rDNA序列测定可知1#、3#和5#菌株的DNA碱基对分别有1 446 bp、1 441 bp、1 355 bp。1#、3#和5# 菌株的核酸序列(BlastN)结果与克雷伯氏菌属高度相似，判断三株菌株均为克雷伯氏菌属。表3

研究表明，1#和3#都聚在同一分支内,相似性达到98%，说明1# 和3# 为同一种菌，且与序列号为Y17657的菌株100%相似，因此，1#和3#菌株鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiellapneumoniae)；5#菌株与序列号为AF129440的菌株95%相似，相似性极高，因此，鉴定为5#菌株酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。图6

表3 三株菌株的核酸序列(BlastN)比对
Table 3 Comparison of nucleic acid sequences (BlastN) of three strains

菌株Strain对同源性最高的菌株的描述(登录号)Description of the strain with the highest homology (login number)最大值Max score总分Total score序列覆盖Query cover(%)EE value相似度Ident1#Klebsiella pneumoniae strain 19051, complete genome(CP022023.1 )2 67121 254100%0.0100%3#Klebsiella pneumoniae strain MLST-15, complete genome(CP022127.1 )2 6621 186100%0.0100%5#Klebsiella oxytoca strain M1 16S ribosomal RNA gene,partial sequence(KC462193.1)2 4792 47999%0.099%

图6 三株菌株的16S rDNA的序列系统发育树
Fig.6 Sequence phylogenetic tree of 16S rDNA of three strains

3 讨 论

微生物鉴定用传统的方法费时费力，但鉴定结果准确性低等不足，而用Biolog可以快速的鉴定，并能大大缩短了试验的周期，且鉴定系统会自动的显示准确率较高的结果[25]，并结合16S rDNA构建的系统发育树分析，微生物鉴定的效率与准确性将大大的提高。然而在微生物鉴定中，Biolog微孔鉴定板的显色受多种因素的影响，比如：微生物的种类，活性与数量，培养的温度时间。在鉴定的过程中要严格按照Biolog GenⅢ 操作流程进行微生物的鉴定操作[26]，减少误差。

国内外研究筛选的植物促生菌中部分菌株有生物防治的作用[27]，其中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)被广泛的研究，黎志坤等[28]筛选到一株番茄根际优势细菌YPP-9，其在番茄的根际有较好的定殖能力，并对植物青枯病菌茄科雷尔氏菌具有拮抗的作用。张冬冬等[29]从棉花土壤中分离的芽孢杆菌Z-5菌株，对棉花黄萎病有较高生物防治效果，能够在棉花根际土壤及植株体内有效定殖。从盐碱地筛选出的有ACC脱氨酶活性的PGPR能够促进植物的生长，还能缓解盐含量对植物的抑制作用[30-31]。Santoro等[32]筛选的PGPR能够产IAA(吲哚乙酸)能力和溶磷能力，能提高香料作物的产量。龚凤娟等[33]从杜仲根中筛选分离到具有ACC脱氨酶的菌株有Pseudomonaskoreensis、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)、变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)和阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)。张国壮等[11]从旱地小麦根系土壤中筛选分离到具有ACC脱氨酶的菌株，有阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)，非脱羧勒克氏菌(Leclerciaadecarboxylata)。可以发现龚凤娟，张国壮等[11]筛选到产ACC脱氨酶的菌株都以肠杆菌为主。

ACC脱氨酶能降低植物体内过量的乙烯，使植物在水涝、重金属、干旱、盐碱等逆环境下可以减少伤害正常的生长。在土壤中筛选产ACC脱氨酶活性的菌株，提高植物的抗逆性，促进或调节植物的生理生长，增加土壤盐碱地的利用率，已成为国内外研究的热点[34]。研究发现小麦种子用产ACC脱氨酶的细菌接种后，能明显的减少干旱胁迫下对它生长的影响[35]。从生长于盐渍土壤的油菜根际中筛出的产ACC脱氨酶细菌，研究表明这些细菌有助于提高油菜的耐盐性[36-37]。

筛选出的三株产ACC脱氨酶细菌对农作物病原菌的抑菌活性，对植物的促生试验，对农作物幼苗生长的促生作用和耐盐碱试验还需通过盆栽实验验证。

4 结 论

利用ACC为唯一的氮源，以盐穗木根际土壤为样品，定向富集，分离筛选到三株具有产ACC脱氨酶的菌株，进行菌落形态观察和生理生化试验，用Biolog和16S rDNA分子生物学这两种方法对分离的三株菌株鉴定的结果中1#和5#菌株相吻合，1# 鉴定克雷伯氏菌属(Klebsiellapneumoniae)，5#属于酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，而3#菌株用两种方法鉴定的结果不一致，16S rDNA分子生物学的方法鉴定的是克雷伯氏菌属(Klebsiellapneumoniae)，但用Biolog GenⅢ 板鉴定，在ID地址栏中显示到最佳的匹配名称为酸性克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，排在第二位的是克雷伯氏菌属的Klebsiellapneumoniae，原因可能是在Biolog鉴定过程中由于操作不规范造成的，或是培养条件的原因引起的，经过生理生化试验和形态学的观察，综合分析，3# 菌株最终鉴定为克雷伯氏菌属的Klebsiellapneumoniae。

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