盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8在盐胁迫下的表达与相关性分析

张慧珍，黄世平，杨瑞瑞，曾幼玲

(新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】盐胁迫影响植物生长和作物的产量。在应对盐胁迫过程中，植物通常会采用不同的机制来避免盐离子过度累积造成的损伤[1]。在这错综复杂的分子调控网络中，miRNA对靶基因的调控就是其中的一种。【前人研究进展】miRNA是一类长度约为21 nt的非编码小RNA。它们能够直接对mRNA进行切割或者阻止其翻译，在转录后水平调控编码基因的表达[2, 3]。鉴定miRNA与靶基因间的靶向关系，一方面，通过生物信息学获得miRNA预测的靶基因，另一方面设计试验进一步鉴定miRNA与这些潜在靶基因的关系。研究方法主要包括：(1) 利用qRT-PCR验证miRNA与靶基因的负相关性，即在靶基因与miRNA的转录水平看两者的表达是否存在调控关系[4]；(2) 5′ RLM-RACE分析miRNA与靶基因的靶向切割位点，能直接证明miRNA对靶基因的靶向切割关系[5, 6]；(3) 将靶基因与GFP或GUS等报告基因融合，通过烟草瞬时表达体系，直观地验证miRNA与靶基因的互作关系[7, 8]。miRNA在植物中具有高度保守性、时序性和组织特异性，在各种生物学进程中都扮演着重要角色，miR167是作用于生长素信号通路上的一类miRNA，它通过靶向ARFs来调控下游生长素响应基因的转录。有文献报道，miR167主要靶向的是ARF6和ARF8两个成员[9, 10]。最近的研究表明，在植物的生长发育中，ARF6和ARF8参与雌蕊群和雄蕊群的发育，其过表达会促进雌、雄蕊的发育或导致植物早熟[9-12]。牵牛(Ipomoea.nil)开花时期miR167表达量最低，ARF8的表达量却是最高的，二者的表达模式呈现负相关性。大豆miR167c在根部表达上调，通过靶向GmARF8a和GmARF8b直接调控根瘤的数目[13]。Jodder等[14]探究不同胁迫条件下番茄miR167a的表达调控机制，发现真菌或病毒感染及冷胁迫提高了miR167a的表达水平，而盐、旱和热处理导致其下调表达，表明不同的胁迫可能激活了番茄miR167a不同的调控途径。盐胁迫下，miR167在拟南芥[15]和中间锦鸡儿(Caraganaintermedia)[16]中都呈现上调表达，这可能是通过调节ARF的表达，影响植物生长素响应相关基因的转录，减缓了植物的生长和发育，并且通过这种方式提高植物的胁迫耐受性[17]。【本研究切入点】盐穗木(Halostachyscaspica)隶属藜科(Chenopodiaceae)盐穗木属(Halostachys)，对盐分适应性极强，能够高度富集Na+和Cl-[18-21]。研究是基于课题组前期构建的高盐胁迫下盐穗木根的小RNA文库数据[22]，依据测序拷贝数筛选受盐诱导表达显著下调的miR167d及利用盐穗木转录组数据预测到的靶基因ARF8为研究对象。【拟解决的关键问题】探讨盐胁迫下盐穗木miR167d及预测靶基因ARF8在高盐(600 mmol/L NaCl)胁迫下的表达模式和相关性；同源克隆方法结合RACE技术，克隆获得盐穗木ARF8全长序列并进行生物信息学分析。该文为进一步研究盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8的耐盐生物学功能和调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

盐穗木种子采自新疆古尔班通古特沙漠边缘，培养基质按1∶1∶1 (花土∶珍珠岩∶蛭石)的比例配置。置于温室中生长(25℃，光照时间16 h/d，相对湿度40%)，植株生长大约90 d实施盐胁迫处理。600 mmol/L NaCl处理盐穗木0、3、12、24、48、72 h (自来水浇灌的盐穗木作为对照)，取其同化枝为试验材料，液氮速冻并保存于-80℃冰箱用于后续的基因表达荧光定量试验。

烟草种子播种于花盆中，培养基质按2∶1∶1(花土∶珍珠岩∶蛭石)配制，置于温室中生长(25℃，光照时间16 h/d，相对湿度40%)，每周浇一次自来水。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

RNA的提取步骤参照北京天根Plant Total RNA提取试剂盒的操作说明。

1.2.2 盐穗木miR167d与ARF8的反转录及荧光定量PCR

利用polyA加尾法对total RNA进行反转录合成cDNA。按照TaKaRa公司SYBR®PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit进行miRNA的荧光定量实验。

按照M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒(TaKaRa)和Oligo(dT)18 primer等反转录试剂合成cDNA用于定量分析。按照SYBR®Select Master Mix(Applied Biosystems)操作说明进行靶基因的荧光定量试验。ABI 7500荧光定量PCR仪进行荧光定量实验，用2-△△Ct方法计算miRNA和靶基因的相对表达量，Prism5.0分析并作图。

按照SMARTerTM RACE cDNA (Clontech)扩增试剂盒，以RNA为模板反转录合成5'-RACE-Ready-cDNA和3'-RACE-Ready-cDNA，用于靶基因RACE实验。

1.2.3 盐穗木预测靶基因ARF8的克隆、理化性质及同源分析

分别以5'-RACE-Ready-cDNA和3'-RACE-Ready-cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物回收后，经连接、转化，测序鉴定正确后，通过拼接，获得全长序列，进而设计引物(HcARF8-P1；HcARF8-P2 )，扩增HcARF8的全长序列(引物序列信息见表1)。NCBI Conserved Domain Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线预测其保守性，分析盐穗木ARF8蛋白质的保守结构域。表1

1.2.4 农杆菌注射法转化烟草叶片

利用盐穗木转录组数据未找到其miR167d前体。通过盐穗木和拟南芥的miR167d成熟体比对分析发现仅存一个碱基的差异，推测拟南芥miR167d的成熟体可能对盐穗木miR167d预测的靶基因同样存在靶向切割，故分别构建可能包含有拟南芥miR167d剪切位点的pCAMBIA1301-HcARF8-GFP和pCAMBIA2300-AtmiR167d相关的植物表达载体，转化农杆菌EHA105，鉴定正确后，拟通过烟草瞬时表达实验鉴定拟南芥miR167d对盐穗木ARF8是否具有靶向作用。

将鉴定正确的农杆菌EHA105单菌液培养至OD600为0.8～1.0，12 000 r/min离心1 min，收集菌细胞，用重悬液[10 mmol/L MES-KOH，10 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone )]重悬，单菌液OD600调为0.5，混合菌液OD600调为1.0，室温静置4 h；用去掉针头的1 mL注射器吸取菌液，用注射器针头在叶片上轻轻划出小孔，用装有菌液的注射器压住小孔，慢慢用力，将菌液分别或共转入生长状态良好、健壮的烟草叶片(避开叶脉)中；3～5 d后撕取叶片下表皮，于Nikon ECLIPSE Ti荧光显微镜下观察。

表1 试验所用引物序列
Table 1 Primer sequences used in the experiments

名称Name引物Primer 引物序列 (5’-3’)Primer sequences (5’-3’)qRT-PCRRmiR167dTGAAGCTGCCAGCATGATCTGRHcARF8-P1/P2TGGTCCTTGGGAGGCATTCTTG/CTTGAAGAGGGTATGCGGGGATHc5S rRNA-P1/P2ACCCGATCCCATTCCGAC/TGTCTCCCGAACAATCTCAGTACHcβ-actin-P1/P2AAGATCTGGCACCACACCTTC/CACACCATCACCAGAATCGAHcARF8HcARF8-P1/P2ATGAAGCTTTCAACATCAGGATTG/GTACGTCTCAGTCCCTTGCTTCCHcARF8 5'RACE-OuterGACCATCTCCAAGGAGAAGTACATCATTCHcARF8 5'RACE-InnerCTCCCTGTCGACAAATACAAGCTGCCAGHcARF8 3'RACE-OuterGTTGGGGAAGCAAGGGACTGAGACGTACHcARF8 3'RACE-InnerAGACCATATCCCCGCATACCCTCTTCUPM (Long)CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPM (Short)CTAATACGACTCACTATAGGGCNUPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT烟草瞬时实验pCAMBIA2300-AtmiR167d-P1 (SacI)GAGCTCTGTTGGTTTTTAGAAGCTGAAGCpCAMBIA2300-AtmiR167d-P2 (BamHI)CTGCAGTGTTGGTGATTTAGTGACTGAAGpCAMBIA1301-HcARF8-GFP-P1 (SacI)GAGCTCATGTCCCGGTTCAGCAGCTATCATGpCAMBIA1301-HcARF8-GFP-P2 (PstI)GGATCCGTACGTCTCAGTCCCTTGCTTCC

2 结果与分析

2.1 盐穗木miR167d与靶基因的靶向预测

根据靶向关系的基本原则[23, 24]，利用高盐胁迫下盐穗木根的小RNA文库和转录组数据信息分析，盐穗木miR167d预测的靶基因为盐穗木ARF8，其作用的靶位点靠近编码区3'端位置。盐穗木miR167d成熟体与拟南芥miR167各成员的成熟体比对有1～4个碱基的差异。图1

图1 盐穗木miR167d的靶基因预测(A)以及与拟南芥miR167各成员成熟体的比对(B)
Fig.1 Predicting target gene ofHalostachyscaspicamiR167d (A) and alignmenting with AtmiR167 family members (B)

2.2 盐胁迫下盐穗木miR167d与其预测靶基因HcARF8的表达模式

qRT-PCR检测到盐穗木miR167d和ARF8都受到600 mmol/L NaCl高盐胁迫的诱导。高盐胁迫处理48 h，盐穗木同化枝miR167d显著上调表达并与HcARF8呈现显著的负相关性。HcARF8的表达随着盐胁迫时间的延长呈现先上升后下降的趋势。同时，结合生物统计学软件(IBM SPSS Statistics V19)对盐穗木miR167d及其靶基因ARF8进行了相关系数分析。图2，表2

注：差异极显著***/**(P<0.01)；差异显著*(P<0.05)

Note:P<0.01 was extremely significant (***/**) andP<0.05 was significant (*)

图2 600 mmol/L NaCl处理盐穗木同化枝miR167d (A)及其预测靶基因HcARF8 (B)的相对表达模式 (C)
Fig.2 The relative expression of miR167d (A) and its predictive target geneARF8 (B) at the treatment of 600 mmol/L NaCl in theHalostachyscaspicabranches (C)
表2 高盐胁迫处理盐穗木同化枝miR167d与预测靶基因ARF8的相关性分析
Table 2 Correlation analysis on miR167d and its target geneARF8 at the treatment of 600 mmol/L NaCl in theHalostachyscaspicabranches

处理TreatmentR2P值P value 显著水平Significant3 h (600 mmol/L NaCl )0.7230.1045ns48 h (600 mmol/L NaCl)-0.94570.0043**600 mmol/L NaCl-0.80440.0292*

注：差异极显著**(P<0.01)；差异显著*(P<0.05)

Note:P<0.01 was extremely significant (**) andP<0.05 was significant (*)

2.3 烟草瞬时表达体系鉴定拟南芥miR167d对盐穗木ARF8的靶向作用

选取包含miR167d靶位点的盐穗木ARF8片段(252 bp)和AtmiR167d(377 bp)分别构建到植物表达载体pCAMBIA1301-GFP和pCAMBIA2300上，转化农杆菌EHA105，单独及同时注射烟草叶片，用荧光显微镜观察瞬时转化后烟草表皮中GFP融合蛋白的表达情况。转化了pCAMBIA1301-HcARF8-GFP后，在激发光的作用下，烟草细胞中有绿色荧光，位于保卫细胞气孔周围(图3A, B)；而将pCAMBIA1301-HcARF8-GFP与pCAMBIA2300-AtmiR167d同时转入烟草叶片后，表皮细胞中无绿色荧光(图3C, D)，这些都以野生型为对照(在明场、荧光场中均无荧光)(图3E, F)。图3

注：A, B分别为转化pCAMBIA1301-HcARF8-GFP的明场及荧光场下的烟草表皮细胞；C, D分别为转化pCAMBIA1301-HcARF8-GFP与pCAMBIA2300-AtmiR167d的明场及荧光场下烟草表皮细胞；E, F分别为野生型烟草明场及荧光场下的表皮细胞

Note: The tobacco epidermal cells were detected under the bright field and the fluorescent field by the observation of fluorescence microscope, which were transformedHcARF8-GFP fused gene with the plant expression vector pCAMBIA1301byagrobacteriummediated method (A, B),HcARF8-GFP andAtmiR167d with the vector pCAMBIA1301and pCAMBIA2300 by the same method (C, D) and those of wild type ( E, F), respectively

图3 烟草瞬时转化体系鉴定拟南芥miR167d与盐穗木生长素响应因子ARF8的靶向作用
Fig.3 Targeting verification ofArabidopsismiR167d andHalostachyscaspicaauxin response factorARF8 using tobacco transient expression system

2.4 盐穗木生长素信号通路中靶基因ARF8的克隆

利用RACE方法克隆获得了盐穗木miR167d预测的靶基因ARF8序列，全长为2 861 bp，ORF 2 442 bp，编码813个氨基酸。盐穗木ARF8推测的氨基酸序列与同科植物甜菜(Betavulgaris)ARF8的同源性最高，达到87%。

NCBI Conserved Domain Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对其保守性进行预测，含有能与B3 DNA绑定元件、生长素响应元件，生长素诱导转录IAA超家族的元件结合的结构域，表明该蛋白是生长素响应因子。图4

图4 盐穗木ARF8全长基因的克隆(A)及编码蛋白结构域的预测(B)
Fig.4 Cloning ofHalostachyscaspicaARF8 full length gene (A) and predictive structure domain of this speciesARF8 (B)

3 讨论

盐穗木是一种荒漠极端耐盐植物，其茎叶已高度肉质化[25]。很多研究报道miR167调控生长素信号通路中的ARF基因，它作为一个调节子参与信号通路的调控，不仅调节植物的生长发育，还调控植物应对各种环境胁迫[9, 10, 13, 17]。实验主要开展了高盐胁迫下盐穗木同化枝miR167d及其靶基因ARF8的表达模式以及相关性研究。

该文从前期获得的高盐胁迫下盐穗木根的小RNA文库和转录组数据中生物信息学分析miR167d与预测的靶基因具有一定的靶向性。NaCl高盐胁迫real-time PCR的检测结果显示了盐穗木同化枝miR167d表达显著上调，Liu等[15]和Zhu等[16]在拟南芥和中间锦鸡儿中也发现类似的miR167上调表达的情况。对高盐浓度不同时间点胁迫处理的盐穗木，其同化枝中miR167d与其靶基因的表达呈现极显著的负相关性 (表2和图2)[4]。拟南芥miR167d与盐穗木miR167d成熟体仅存在一个碱基的差异，烟草瞬时表达实验的结果显示拟南芥miR167d对盐穗木ARF8起到了剪切作用，这个结果间接地能推断盐穗木miR167d对其预测的靶基因HcARF8存在靶向切割，这与之前相关文献中的报道[7, 8, 26]相一致。

根据前期课题组获得的miR167d的靶基因ARF8转录组的序列信息，通过RACE的方法，获得了HcARF8基因的全长序列(2 861 bp)，NCBI在线BLAST发现HcARF8编码的氨基酸序列与同科植物甜菜的同源性达到87%，盐穗木ARF8存在能与生长素相关的元件(B3 DNA绑定元件、生长素响应元件，生长素诱导转录IAA超家族的元件)结合的结构域，这也进一步证实了该序列就是HcARF8。这些结果为进一步研究盐穗木miR167d和靶基因HcARF8之间的调控和生物学功能奠定基础。

4 结 论

以高盐(600 mmol/L NaCl)处理48 h盐穗木根的小RNA文库中筛选到差异表达的miR167d和从转录组数据中预测到其靶基因HcARF8作为研究对象。荧光定量PCR试验证明高盐胁迫下盐穗木同化枝中miR167d和预测靶基因均响应高盐胁迫，且胁迫48 h时，二者的表达量呈现显著的负相关性，结合烟草瞬时表达试验的结果可以推断盐穗木miR167d与盐穗木ARF8存在靶向关系；进而利用同源克隆方法结合RACE技术获得了盐穗木miR167d的靶基因HcARF8的全长序列(2 861 bp)，生物信息学分析与同科植物种甜菜ARF8同源性达到87%，都具有与生长素相关元件结合的功能域。

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