非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及意义

石柳 汤建华 温建军 曹德清 刘雪 林晔 张静智

【摘要】 目的：探讨非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及其对肝细胞脂代谢的影响。方法：通过Western-blotting，透射电镜、Nanosight鉴定exosomes；并通过BCA蛋白定量的方法检测19例NAFLD患者（NAFLD组），18例健康对照（健康对照组）血清中exosomes内蛋白含量；将10 μg的exosomes与HepG2细胞共培养，48 h后，收集细胞，GPO-PAP法检测其中总胆固醇（TC）和总甘油三酯（TG）的表达；通过Western-blotting檢测腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平。

结果：exosomes高表达CD9、CD63、CD81，呈圆形或椭圆形，直径在40～210（110.00±21.36） nm。NAFLD组中的exosomes蛋白水平明显高于健康对照（P<0.05）。exosomes与HepG2细胞共培养后，其TC、TG的表达水平与对照组相比明显上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：exosomes可影响AMPK通路的活性，在肝细胞的脂代谢过程中发挥了重要作用，促进了非酒精性脂肪肝的发展。

【关键词】 非酒精性脂肪肝； exosomes； AMPK； 脂肪代谢

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种慢性代谢应激性肝损伤，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，发病率在全球范围内达10%～40%[1]。其病理改变与酒精性肝损伤类似，但患者无酗酒病史。近年来，NAFLD的发病率呈快速增长且趋低龄化，与心血管死亡率增加具有相关性，已成为影响人类健康的重要障碍之一[2-3]。高血脂、高血糖、肥胖是NAFLD的危险因素，然而其发病机制十分复杂，目前的报道提出的“二次打击”学说，四步骤学说等均不能完全解释清楚其发病机制[4]。

外泌体（exosomes）是一种由细胞分泌的，直径为40～100 nm的小囊泡参与胞间通讯，介导多种生理及病理过程[5]。exosomes包含着蛋白质、microRNA、LncRNA等生物活性物质[6]。exosomes由于具有膜性结构，能稳定存在不易被降解，可将有效的生物活性物质运送至靶组织发挥作用。本研究通过检测NAFLD患者血清中exosomes的水平及其对肝癌细胞HepG2的作用，探索其在NAFLD进展中的作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取NAFLD患者19例（NAFLD组，男10例，女9例），同时选取年龄性别匹配的体检健康者18例（健康对照组，男9例，女9例）。纳入标准：（1）2016年6月-2017年6月本院就诊的NAFLD患者；（2）本研究所需的检查资料完整；（3）所有入组对象均签署知情同意书。排除标准：（1）病毒性、药物性、酒精性等原因引起的肝脏疾病；（2）长期大量饮酒病史；（3）严重的心、肾脏疾病及其他内分泌系统疾病。NAFLD的诊断标准按照中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）》。本研究通过医院医学伦理委员会批准，抽取外周静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清，-80 ℃保存。

1.2 试剂和仪器 人肝癌细胞株HepG2（武汉中国典型培养物保藏中心），exosomes提取试剂盒（锐博公司），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天公司），酶标仪（Bio-Tek公司），兔多克隆抗体AMPK（CST公司），兔多克隆抗体p-AMPK（CST公司），Nanosight（技术服务），透射电子显微镜（技术服务），TC、TG检测试剂盒（南京建成生物）。

1.3 血清中exosomes的蛋白含量检测 收集研究对象的外周血血清250 mL，按锐博试剂盒说明书进行exosomes的提取。取20 μL样品用RIPA裂解后，通过BCA法检测其蛋白含量。

1.4 exosomes的鉴定 通过Western-blotting法检测exosomes的表面特异性标记CD9、CD63、CD81，Nanosight其直径分布。投射电镜观察其形态。

1.5 GPO-PAP法测定TC、TG的表达水平 将10 μg的exosomes加入HepG2细胞中共培养48 h后，收集细胞加入裂解液，按TC、TG测定试剂盒进行检测。

1.6 AMPK磷酸化水平检测 Western-blotting检测细胞裂解物中AMPK的磷酸化水平。

1.7 统计学处理 本研究所有数据采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组之间比较采用t检验或Manne Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 exosomes的鉴定 Western-blotting结果示，exosomes表达CD9、CD63、CD81（图1A），通过透射电镜下观察exosomse的形态，其呈圆形（图1B），Nanosight示直径为（110.00±21.36）nm，带有完整的膜性结构（图1C，Bar 200 nm）。

2.2 不同来源血清exosomes中蛋白含量的比较 NAFLD组和健康对照组，分离提取exosomes后，BCA结果示，NAFLD组exosomes中的蛋白含量为（1.31±0.15）mg/mL，明显高于健康对照组的（0.72±0.12）mg/mL，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3 exosomes影响HepG2细胞TC、TG的表达 10 μg的exosomes与 HepG2细胞共培养48 h后，检测细胞裂解物中TC、TG的表达水平，结果显示，NAFLD组患者来源的exosomes能促进HepG2细胞表达TC、TG，其中TC为（0.85±0.23）mmol/gprot vs （0.15±0.07）mmol/gprot，TG为（0.97±0.18）mmol/gprot vs （0.28±0.06）mmol/gprot，且差异均有统计学意义（P<0.05），见图3。

2.4 exosomes對HepG2细胞AMPK磷酸化水平 AMPK信号通路是脂肪代谢最重要的途径之一，exosom是否通过该通路调控HepG2细胞的脂代谢呢？进一步检测exosomes对HepG2细胞AMPK磷酸化水平的影响，Western-blotting结果示，与健康对照组相比，NAFLD组患者来源的exosomes能抑制AMPK的磷酸化水平，AMPK的活性受到了抑制，见图4。

3 讨论

NAFLD表现为弥漫性的肝实质细胞脂肪变形坏死，患者无过量饮酒史，肥胖、2型糖尿病、血脂、血压异常也增加了NAFLD的患病风险，这几个因素之间相互影响[7]。近年来对NAFLD的诊断及治疗得到了很大的提升，然而其发病率仍居高不下，疗效仍欠佳。随着研究的不断深入，研究者发现了exosomes参与了许多疾病的发生及发展，在机体不同系统之间的通讯起了重要的作用。Peinado等[8]研究发现，恶性黑色素瘤的exosomes可调节骨髓祖细胞的活动，从而促进肿瘤的转移，且exosomes的表达水平与患者的预后密切相关。同时，不断有研究指出，exosomes在疾病的不同发展时期有着特异性表型，尤其在肝脏疾病中，exosomes可影响肝细胞的生长方式[9-10]。因此，有学者提出exosomes可能作为一个潜在的疾病生物学标记物，可作为液体活检应用于包括NAFLD在内的慢性疾病中[10-12]。

本研究结果显示，血清中exosomes水平与NAFLD具有密切的关系。在NAFLD患病组中的exosomes水平与健康对照相比明显升高（P<0.05），这表明，exosomes在一定程度上反映了NAFLD疾病的发展程度。其可能的原因是：exosomes具有的脂质双分子膜性结构使得其可将核酸、蛋白质等生物活性物质随体液循环运输至全身各器官组织，调控靶细胞的生命活动。在NAFLD进展过程中，各系统代谢出现异常，因此出现exosomes的改变。同时，文献[12-14]报道，胃癌患者血清中的exosomes与肿瘤的转移、TNM分期及分化程度密切相关。许多研究指出，exosomes可作为载体将RNA转移至远处组织，并在受体细胞中检测目的蛋白的表达[15-16]。这表明，exosomes可稳定地运输RNA，并借用靶细胞中的翻译工具完成蛋白的表达。有趣的是，最近有研究指出，检测血液中exosomes的蛋白磷酸化水平可作为监测乳腺癌进展的手段[17]。以往的研究表明，蛋白的磷酸化和去磷酸化可作为许多生命活动的开关，直接调控疾病的发生发展。本研究中，笔者也发现了在NAFLD来源的exosomes可抑制HepG2细胞的AMPK的磷酸化水平，从而影响其脂代谢过程，导致甘油三酯和总胆固醇的累积。据报道，AMPK是脂代谢途径最重要的蛋白之一，其活性受抑制后，可导致脂肪沉积及胰岛素抵抗[18-20]。由此，exosomes可能携带了母细胞的某些活性物质至靶细胞，影响靶细胞的功能，最终通过级联效应，影响肝脏细胞分解代谢脂肪。与我们的研究结果一致，于宁等[21]也提出，胆汁中的exosomes可以下调细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化水平，促进miR-15A的表达，从而导致抑制胆管上皮细胞的生长。由此，exosomes在肝脏疾病的发展中发挥着重要作用。可以通过检测血清中exosomes测患者的疾病进展，替代病理学对疾病进行诊断，作为无创诊断的标志物。以exosomes为代表的液体活检的发展，将大大促进对NAFLD的诊治。

本研究创新性地提出了exosomes通过携带生物活性物质，影响靶细胞的AMPK磷酸化水平，从而影响了NAFLD的发展，为疾病的诊治提出了新的靶点。然而，由于缺乏对exosomes作用机制的深入研究，本研究仍无法阐释exosomes如何通过AMPK影响NAFLD的进展。下一步应通过蛋白组学研究exosomes的成分，并通过生物信息学分析，筛选可能作为exosomes作用“帮手”的目的蛋白，进一步揭示exosomse的作用机制，为其进一步应用提供理论基础。

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（收稿日期：2018-05-29） （本文编辑：程旭然）