基于ATP7A探讨粉防己碱对乳腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及机制

肖奕 马大昌 王红磊 吉琨 武力

[摘要] 目的 基于ATP7A探讨粉防己碱对乳腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及机制。 方法 建立两种人乳腺癌顺铂耐药细胞株及ATP7A高表达细胞。检测粉防己碱对顺铂耐药细胞的逆转作用，高效液相色谱测定胞内顺铂含量，检测ATP7A蛋白表达。 结果 耐药乳腺癌细胞的顺铂敏感性显著降低（P < 0.05），ATP7A表达升高（P < 0.05），胞内顺铂含量明显降低（P < 0.05）；ATP7A高表达细胞较正常乳腺癌细胞顺铂敏感性下降（P < 0.05），胞内顺铂含量降低（P < 0.05）。而粉防己碱对细胞耐药性具有明显的逆转作用，较耐药细胞及转染细胞可升高胞中顺铂含量（P < 0.05），降低ATP7A表达（P < 0.05）。 结论 粉防己碱对人乳腺癌顺铂耐药细胞及ATP高表达细胞的顺铂耐药性有逆转作用，其机制可能与抑制ATP7A表达相关。

[关键词] 粉防己碱；乳腺癌；顺铂耐药；ATP7A

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0018-05

顺铂是乳腺癌化疗一线用药，但耐药严重影响临床疗效[1-2]。ATP7A参与肿瘤对顺铂的泵出，耐药乳腺癌细胞中表达明显增高[3-4]。粉防己碱对肿瘤耐药具有逆转作用[5-7]，可提高阿霉素在人口腔上皮癌耐药细胞中的浓度；与苦参碱联用可有效提高多柔比星对乳腺癌的细胞毒性[8-9]，但对其在乳腺癌顺铂耐药中的作用有待探究。本研究采用两种人乳腺癌细胞株建立顺铂耐药细胞及ATP7A高表达乳腺癌细胞，考察粉防己碱对不同顺铂耐药细胞的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco，美国）；粉防己碱、顺铂、DMSO（Sigma公司，美国）；BCA蛋白测定试剂盒（碧云天生物研究所，中国）；LipofectamineTM2000（Invivogen，法国）；pCMV6/ATP7A转染试剂（上海吉玛生物公司，中国）；ATP7A、GAPDH（abcam，英国）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 顺铂耐药MDA-MB-231、MCF-7细胞的建立

取对数生长期MDA-MB-231、MCF-7细胞，加入终浓度为100 ng/mL的顺铂，培养，传代；当细胞适应后，适当增加顺铂浓度（30～50 ng/mL），保证细胞可稳定生存、传代，6周后得到稳定耐药细胞株MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP，停用顺铂培养2周后取处于对数生长期的细胞进行后续实验[10]。

1.3 pCMV6/ATP7A转染MDA-MB-231、MCF-7细胞的建立

MDA-MB-231、MCF-7细胞以每孔1×105/mL密度接种于6孔板中，待铺满80%底面积进行转染，根据LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染不同质粒。将质粒pCMV6/ATP7A转染到MDA-MB-231、MCF-7细胞中。质粒DNA和脂质体的用量每孔分别为1 μg/μL和2 μL。瞬时转染后48 h，给予顺铂及粉防己碱干预。

1.4 MTT试验

对数生长期的MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP乳腺癌细胞接种于96孔培养板，接种密度为1×105/mL，24 h后加入不同浓度的顺铂（MDA-MB-231/DDP及ATP7A转染MDA-MB-231细胞：5、10、20、40、80、160 mg/L；MCF-7/DDP及ATP7A轉染MCF-7细胞：2.5、5、10、20、30、60 mg/L），每孔总体积为200 μL，再孵育24 h后吸出培养基，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，继续孵育4 h，吸去MTT液，加入200 μL DMSO，振荡15 min，490 nm测定吸收值。

1.5 胞内顺铂浓度检测

取MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP、ATP7A转染后的MDA-MB-231、MCF-7细胞及给予粉防己碱预处理12 h的细胞，在含有5 μg/mL顺铂培养液中培养4 h，用冷PBS洗2次，2700 r/min离心5 min，高效液相色谱测定胞内顺铂含量（顺铂浓度用测定每1×106个细胞中顺铂量表示）。色谱条件：色谱柱4.0 mm×150 mm；5 μm的U-Bondapak-C18H37化学键合反相固定相；流动相，甲醇-水（80∶20）；流速1 mL/min；检测波长254 nm[11]。

1.6 Western blot试验

冰预冷生理盐水洗收集的细胞2次，RIPA细胞裂解液提取总蛋白质。提取液蛋白质浓度用BCA 试剂盒定量。将蛋白提取液用10% SDS-PAGE进行电泳分离，用ATP7A（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）单克隆抗体孵育过夜，之后再用具有辣根过氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同乳腺癌细胞对顺铂的敏感度

在同等顺铂给药剂量下，顺铂对模型细胞MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP的抑制率较正常乳腺癌细胞明显降低（P < 0.05），提示顺铂耐药细胞模型建立成功。此外ATP7A高表达的乳腺癌细胞在同等顺铂给药剂量下，与正常乳腺癌细胞比较抑制率同样降低（P < 0.05）。见图1。

2.2 不同乳腺癌细胞内顺铂含量

耐药MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP细胞相较于正常乳腺癌细胞，胞内顺铂浓度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。转染ATP7A的MDA-MB-231、MCF-7细胞相较于普通乳腺癌细胞，胞内顺铂的浓度同样显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 粉防己碱对乳腺癌细胞顺铂敏感性的影响

不同浓度（0.5、2.5、10、25 μg/mL）的粉防己碱给予不同顺铂耐药乳腺癌细胞。随着浓度的提高，粉防己碱对乳腺癌细胞具有一定的抑制作用，10、25 μg/mL粉防己碱对乳腺癌耐药细胞具有明显抑制作用，与对照组（未给予药物干预的乳腺癌细胞）比较差异有统计学意义（P < 0.05），见图3a。将无抑制作用的0.5 μg/mL粉防己碱与不同浓度顺铂（5、20 μg/mL）单独或联合给予MCF-7/DDP细胞，可提高等剂量下顺铂在耐药细胞中的抑制率（P < 0.05），见图3b。将无抑制作用的0.5 μg/mL粉防己碱与不同浓度顺铂（20、80 μg/mL）单独或联合给予MDA-MB-231/DDP细胞后，明显提高等剂量下顺铂在耐药细胞中的抑制率（P < 0.05），见图3c。

2.4 粉防己碱对乳腺癌细胞胞内顺铂浓度的影响

给予5 μg/mL的顺铂，粉防己碱干预后MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP细胞内顺铂浓度较未干预组显著升高（P < 0.05）。将粉防己碱给予转染ATP7A的MDA-MB-231及MCF-7细胞，细胞内顺铂浓度分别为（19.7±4.1）、（38.9±5.8）ng/（6×106）cells，与单一给予顺铂的转染细胞中顺铂浓度比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.5 粉防己碱对乳腺癌细胞ATP7A的影响

pCMV6/ATP7A转染细胞中ATP7A高表达，说明转染模型成功，同时给予粉防己碱后可以明显抑制其表达。顺铂耐药细胞MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP中ATP7A较正常细胞明显升高（P < 0.05），但给予粉防己碱后，耐药细胞中ATP7A表达明显降低。见图5。

3 讨论

肿瘤细胞顺铂耐药的主要因素有：细胞降低对顺铂类药物的摄取；胞内蛋白或者生物小分子使顺铂失活；铂类物质与细胞中 DNA形成加合物；细胞自噬促进耐药[13]；以及铂类药物被泵出细胞[12，14-15]，其中泵出细胞是肿瘤细胞顺铂耐药最主要的原因。ATP7A是铜泵出蛋白，其表达水平和顺铂耐药性在多种肿瘤细胞中呈正相关[16]。ATP7A主要分布在人体除肝脏外的大部分组织中[17]。乳腺癌组织中ATP7A表达较正常组织明显增高，抑制ATP7A表达可提高乳腺癌顺铂敏感性[18]。

本研究分别建立两种顺铂耐药乳腺癌细胞，发现同剂量顺铂给药，两种细胞顺铂敏感性明显降低，ATP7A明显升高，胞中顺铂含量显著降低；当给予粉防己碱后，可以明显抑制细胞ATP7A的表达，显著升高耐药细胞中顺铂含量，有效提高耐药乳腺癌细胞对顺铂的敏感性。借助转染技术高表达ATP7A后，正常乳腺癌细胞对顺铂敏感性降低，胞中顺铂含量显著降低，而给予粉防己碱后可抑制细胞中ATP7A的表达，升高细胞中顺铂含量，其中在MCF-7细胞中，给予粉防己碱后其细胞中顺铂含量与正常乳腺癌细胞无显著性差异。

粉防己碱是千金藤属防己科植物粉防己的主要生物活性成分，可促进肿瘤细胞凋亡[7，19-20]。本研究发现粉防己碱可以通过调节顺铂耐药乳腺癌细胞中ATP7A的表达，提高该類细胞顺铂敏感性，该结果为粉防己碱在肿瘤耐药治疗中的使用提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2018-06-19 本文編辑：张瑜杰）