临床腹泻患者艰难梭菌的感染情况和分子流行特征

冯雪君 徐少毅 吴晓燕

[摘要] 目的 了解临床腹泻患者艰难梭菌的感染情况和分子流行特征，为控制医院感染和临床诊疗提供依据。方法 收集2016年1～12月浙江省嘉兴市第二医院临床腹泻患者粪便标本852份作为实验组，同期健康体检成人粪便标本310份作为对照组，厌氧培养获得艰难梭菌的阳性率，并结合毒素基因型和多位点序列分型进行综合分析。结果 实验组852份粪便标本中共分离到108株艰难梭菌，阳性率为12.68%，而对照组310份粪便标本分离到8株，阳性率为2.58%，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；实验组以tcdA+tcdB+菌株为主，占86.11%（93/108），tcdA-tcdB+菌株占5.56%（6/108），tcdA-tcdB-菌株占8.33%（9/108），产毒率为91.67%，而对照组对应毒素基因型别占比为62.50%（5/8），12.50%（1/8），25.00%（2/8），产毒率为75.00%，但两组产毒率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；实验组多位点序列分型发现32种ST型，其中ST54是相对流行的型别，另外CC48是相对流行的克隆群。 结论 临床腹泻患者艰难梭菌的感染率较高，亟需引起临床重视并加强院感防控，预防暴发流行。

[关键词] 艰难梭菌；毒素基因；多位点序列分型；eBURST分析

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0161-04

艰难梭菌（Clostridium difficile，CD）属于革兰阳性厌氧芽孢杆菌，其芽孢能在环境下生存较长时间，并能抵抗多种理化因素，是院内重要的感染病原菌[1-2]。艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的症状表现不一，轻者引起腹泻，严重者引发伪膜性肠炎，且常伴有中毒性巨结肠、肠穿孔、感染性休克等并发症，甚至最终导致死亡[3-5]。研究表明，CDI的发病率已经高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的感染，成為院内感染首要病因[6-7]，但我国迄今为止尚未有针对CDI诊断和治疗的指南、行业标准出台。本文旨在通过了解临床腹泻患者CDI情况，并结合毒素基因检测和多位点序列分型揭示其毒力和亲缘关系特征，为临床针对性治疗和院感防控提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2016年1～12月浙江省嘉兴市第二医院（以下简称“我院”）临床腹泻患者852例为实验组，其中男487例，女365例；年龄18～101岁，平均（65.45±16.48）岁。纳入同期到我院进行健康体检的310名成人为对照组，其中男192名，女118名；年龄21～78岁，平均（46.21±14.38）岁。纳入标准：患者近期出现腹泻，排便次数增多（>3次/d），可伴大便性状改变，可合并发热（>38℃）或腹痛、外周血白细胞升高。排除标准：年龄<18岁；病因明确的感染性腹泻（沙门、志贺菌、轮状、诺如病毒等）；肠功能性疾病，如肠易激综合征等；其他病因明确的腹泻，如药物性腹泻、乳糖不耐受等。

1.2 主要仪器与试剂

厌氧培养箱（YQX-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司）；全自动微生物分析仪（VITEK-Compact2，法国Biomerieux有限公司）；PCR扩增仪（ABI7500型，美国Applied Biosystems有限公司）；电泳仪（DYY-5型，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（ChemiDoc XRS，美国Bio-Rad有限公司）；艰难梭菌显色平板（法国Biomerieux有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 粪便标本采集和处理 采集所有研究对象粪便标本各1份。所有标本经75%乙醇预处理2 h后，接种艰难梭菌显色平板，厌氧箱培养48 h，取黑色粗糙、有特殊气味的菌落经VITEK-Compact2全自动微生物分析仪鉴定并分离后获取艰难梭菌菌株。

1.3.2 艰难梭菌感染的临床腹泻患者相关临床资料收集 查询临床病历，统计艰难梭菌感染的临床腹泻患者近1个月的抗生素使用情况，并按抗生素的数量、种类或者疾病进行整理归类。

1.3.3 毒素基因检测 挑取3～4个CD菌落制成菌悬液，严格按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取艰难梭菌的DNA，参考Persson等[8]的研究方法中引物序列来扩增毒素基因tcdA和tcdB。PCR反应体系为采用25 μL体系，包括Premix Ex Taq HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为95℃预变性15 min，94℃ 30 s，54℃ 40 s和72℃ 40 s共35个循环，最后72℃延伸5 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增的毒素基因条带。

1.3.4 多位点序列分型（MLST） 采用Griffiths等[9]的研究方法，对艰难梭菌7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）进行扩增，直接对产物进行测序，将得到的测序结果与数据库进行比对，获得7个管家基因的等位基因号，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型（sequence type，ST）。

1.3.5 eBURST分析 用eBURST v3（http：//eburst.mlst.net/）软件分析菌株间的亲缘关系，对比标准库中的菌株（http：//pubmlst.org/clostridium difficile），把实现组所有ST型别进行克隆群（clonal complex）、组（groups）和单体（singletons）的归类。默认7个等位基因条件下，如果有6个相同则属于一个分型组（group），当组内有3个或3个以上的ST型，且其中一个ST拥有与之相应的最多数量的单位点突变（single locus variant，SLV），那么该ST可以暂定为该组的始祖ST（founder），该组即可定义为一个克隆群，不能被归类到任何组的ST命名为单体。

1.4 统计学方法

所有数据输入Excel表格中，进行分类汇总，应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用百分率表示，组间比较用χ2检验或Fisher确切概率法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艰难梭菌的分离情况

实验组852份粪便标本中共分离到108株CD，阳性率为12.68%，对照组310份粪便标本分离到8株CD，阳性率为2.58%，两组艰难梭菌的阳性率比较差异有统计学意义（χ2=25.78，P < 0.05）。

2.2 艰难梭菌感染的临床腹泻患者抗生素使用情况

108例CDI的临床腹泻患者中，1个月之内使用过1种或者2种抗生素的腹泻患者数量最多，占49.07%（53/108），使用3种及3种以上的抗生素的患者占26.85%（29/108），主要集中在ICU病房，总体抗生素使用比例达到75.93%（82/108）。临床上使用排名靠前的抗生素分别是头孢菌素类[69.52%（57/82）]、酶抑制剂类[50.00%（41/82）]、氟喹诺酮类[37.80%（31/82）]和碳青霉素类[21.95%（18/82）]抗生素。而1个月之内未使用过抗生素的比例为24.07%（26/108），这其中65.38%（17/26）来自消化内科，主要见于溃疡性结肠炎和慢性结肠炎患者。

2.3 艰难梭菌毒素基因检测情况

实验组108株CD，产毒率为91.67%，而对照组产毒率为75.00%，两组产毒率差异无统计学意义（P = 0.17）。见表1。

2.4 多位点序列分型和eBURST分析

对108株分离于临床腹泻患者的艰难梭菌进行多位点序列分型后，发现了32种ST型，ST54是相对比较流行的型别，共占了17.59%（19/108），其次是ST3占15.74%（17/108），其余ST型数量不等。eBURST分析实验组的108株艱难梭菌和标准库进行比对（截至2018.01.11），发现实验组32种ST型可以归为7个克隆群（CC48、CC11、CC5、CC37、CC99、CC39、CC238）和1个组（G103）。其中CC48是最大的克隆群，包含了21种ST型，且ST48为CC48的始祖，具有较近的亲缘关系，流行范围较广。

3 讨论

近20年欧美CD的感染率呈现稳步上升趋势，特别是核糖体027型菌株的爆发流行，造成巨大经济损失[4，10-11]。临床上，15%～25%的抗生素相关性腹泻、50%～70%的抗生素相关性结肠炎和几乎全部的伪膜性肠炎是由CDI引起[5]。徐凯悦[12]收集了2010～2015年河北4家医院住院腹泻患者粪便标本1013份，分离到CD 172株，阳性率为16.98%；谢和宾等[13]关于住院腹泻患者CD感染率的荟萃分析发现，CD整体合并感染率为19%，已经高于欧美国家的报道，亟需引起我们的重视。

本研究中，实验组患者CD的感染率为12.68%，明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），而艰难梭菌阳性的这部分临床腹泻患者腹泻前1个月至少使用过1种抗生素的比例高达75.93%，是造成CDI的主要诱因，而余下未用过抗生素的26例CDI患者中，有65.38%的患者患有慢性结肠炎和/或炎症性肠病等自身肠道疾病，提示肠道在慢性、反复、多发的刺激因素下导致的炎性水肿，溃疡、出血病变，亦可能是发生CDI的高危因素。2015年美国艰难梭菌感染临床实践指南中，推荐甲硝唑用于轻到中度病情最初治疗，万古霉素用于重症或复杂的CDI[14]。随着越来愈多的治疗失败或复发CDI病例的报道，传统抗生素疗效受到严重挑战，新型抗生素非达霉素、卡达唑胺和利福昔明等亦表现出较好的临床疗效，另外难治性的CDI患者亦可考虑粪便移植[15]。

CD主要通过分泌毒素致病，毒素A和毒素B是其主要致病因子。毒素A是一种肠毒素，由tcdA基因编码；毒素B为一种很强的细胞毒素，由tcdB基因编码[16]。本研究临床腹泻患者108株CD中，产毒率为91.67%，与之前报道结果相似[17]，但两组产毒率差异无统计学意义（P < 0.05），可能与对照组CD阳性例数过少有一定关系。部分CD相关性腹泻患者可以只有毒素B的存在，且这种毒素A阴性而毒素B阳性的患者临床症状更重，耐药性更强，病死率更高。

多位点序列分型常常被用于流行病学研究，有助于了解菌株间的亲缘关系。本研究采用该分型方法对临床腹泻患者108株CD进行分析，共检出32种ST型别，ST54是相对比较流行的型别，分布于多个临床科室，其次是ST3和ST2，但ST37数量较少，不属于相对流行菌株，与Wang等[18]的研究结果比较相似，但与Jin等[19]报道ST37是其主要流行菌株有较大差异，可能存在地域差异，另外也未能检测到高产毒株核糖体027型（相当于ST01）和078型（相当于ST11）。

本研究发现的ST54、ST2、ST26、ST39、ST53均能在两组中发现，研究表明ST型与宿主人群的来源没有明显的相关性，同一ST型离散分布在不同的进化支中，没有明显的聚类现象[20]。eBURST分析发现CC48是本地区最大的克隆群，包含了21种ST型，具有较近的亲缘关系，流行范围较广，所以及时关注临床CD来源的聚集性，并进行有效预防显得尤为重要。虽然我国未报道过聚集性的CD暴发流行，但高毒力的核糖体027型已在广州和北京报道发现[21-22]，需防范于未然。

综上所述，临床腹泻患者CD的感染率较高，亟需引起临床重视并加强院感防控，预防暴发流行，另外CDI形势日趋严峻的情况下，合理规范抗生素的使用和及时有效的院感防控仍不失为有效的预防手段，同时亦需加强CD的临床认知力和实验室的检测能力，特别要关注疾病与CD感染的潜在联系，进行全方面的监测和研究。

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（收稿日期：2018-07-24 本文編辑：封 华）