外泌体功能与临床应用研究进展

魏晓晶 胡晓

[摘要] 外泌体是由细胞分泌的膜性囊泡，是细胞间通讯的重要介质，参与到细胞间生物信号的传递。目前有5种公认且较为常用的提取外泌体的方法。外泌体在临床疾病研究中突破性的进展主要体现在外泌体参与肿瘤疾病的进展、外泌体中的核酸或蛋白可以作为疾病的分子标志物、外泌体可以作为药物的载体进行靶向治疗等方面。外泌体在疾病中行使的功能使其极具向临床应用的优势。本文主要从外泌体的发现、提取方法优缺点及其在临床疾病功能的研究进展这三个方面加以阐述。

[关键词] 外泌体；提取方法；外泌体与临床疾病

[中图分类号] R733 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0045-04

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现[1-2]，1987年Johnstone等[3]将其命名为“exosome”。研究者最初认为外泌体是一种实验的人工制品、废物或死细胞的残留物[1]。到20世纪90年代，Zitvogel等[4]和Raposo等[5]发现外泌体很可能是细胞间相互交流的一种新方式。2007年，Valadi等[6]发现外泌体内携带有核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白质，并可以被其他细胞捕获。这一系列的突破性发现打开了外泌体研究的新篇章。目前，外泌体提取方法各具特色，并能够得到用于研究的外泌体，因此外泌体研究在近几年呈现指数型上涨。外泌体在临床疾病方面也有较多突破性的报道，这种纳米级的小分子有希望替代细胞治疗投入到临床应用之中。

1 外泌体定义与提取鉴定方法

外泌体是携带核酸和蛋白质的直径为30～150 nm的膜性囊泡，外泌体表面表达CD63、CD9、CD81等表面标志物。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）为细胞分泌的由膜包裹的囊泡统称为胞外囊泡，其包括外泌体、外膜泡、微泡、微粒、凋亡小体和其他EV亚群。外泌体起源于质膜循环途径中的膜腔或早期胞内体，这些膜腔或早期胞内体向内凹陷形成管腔内膜泡，进一步发展成为多泡小体，多泡小体在细胞内分子马达的牵引下与细胞表面融合，最终分泌出去[7]。基于外泌体的物理化学和生物化学性质，已经开发了许多用于分离外泌体的技术。

1.1 外泌体提取方法

外泌体提取方法可分为5类，分别是超速离心、超滤、免疫吸附、沉淀法、基于微流控的分离技术等[8-9]。这5种提取外泌体的方法所依据的原理以及其各自的优缺点，见表1。

1.2 外泌体的鉴定

国际细胞外囊泡学会（ISEV）[10]于2014年发布了研究和定义细胞外囊泡及其功能所需要的最少实验要求的指导性声明文件。文中指出：对于外泌体的鉴定必须从形态、蛋白分子标记、粒径大小等三个方面进行鉴定。

使用透射电镜观察外泌体形态特征和大小，在电镜下呈现为杯子样的形态。条件培养基经过高速离心得到的外泌体直径在30～150 nm[11]。动态粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）的方法可检测颗粒的直径大小和纳米粒子的浓度[12-13]，它通过记录在布朗运动下激光照射的单个粒子的运动，然后用统计学的方法计算颗粒直径。外泌体携带有许多不同的蛋白标记，如HSP70和CD81、CD9、CD63等[14]，因此可以使用磁珠增加外泌体的体积从而用流式分析检测其表面标志物，同样可以使用Western blot检测外泌体含有的蛋白标记[15]。国际细胞外囊泡学会规定了最少需要检测的外泌体蛋白标记，包括外泌体内（TSG101等）和外泌体表面蛋白（CD63等）。

2 外泌体功能研究进展

基于外泌体参与细胞间交流的功能，外泌体内携带的核酸/蛋白可以参与疾病的进展，可以作为疾病诊断的分子标记，同样也可作为药物载体靶向特定疾病部位。

2.1 参与细胞与细胞间的交流

外泌体作为细胞间信息交流的载体，将其所携带的核酸和蛋白传递到受体细胞内并影响受体细胞的功能。在生理条件下，细胞通过分泌外泌体介导细胞间信息的传递，间充质干细胞的外泌体和微泡以剂量依赖性方式抑制T淋巴细胞增殖并降低CD4+和CD8+T细胞亚群的比例，外泌体增加了Treg细胞群的数量[16]。树突细胞分泌的外泌体能够募集间充质干细胞，提高间充质干细胞向损伤部位的迁移能力，从而促进损伤局部的修复[17-18]。在病理条件下，肿瘤细胞分泌的外泌体通过与骨髓内造血祖细胞的相互作用，或者是肿瘤细胞直接与淋巴结相互作用，又或者是通过与周围成纤维细胞的相互作用，从而增加肿瘤细胞的迁移能力。Luga等[19]报道成纤维细胞分泌的外泌体通过Wnt-PCP信号通路促进乳腺癌细胞（BCC）的侵袭性行为，揭示了肿瘤细胞通过外泌体拉拢正常细胞促进肿瘤细胞的转移方式。在缺氧的条件下，HIF-1α迅速累积并反式激活基质金属蛋白酶-13（MMP-13）表达[20]，缺氧诱导外泌体装载MMP-13改变微环境从而增强鼻咽癌细胞的迁移能力和侵袭性。Rutgers Biomedical and Health Sciences （RBHS）的研究人员发现，乳腺癌细胞会使间充质干细胞释放含有不同的miRNA（如miR-222/223）的外泌体，从而促进一部分癌细胞处于静止期，并获得抗药性[21]。

2.2 作为疾病的分子标志物

外泌体内携带有癌细胞的DNA、RNA和蛋白质等信息，因此外泌體可以作为癌症的诊断工具。在对胰腺癌患者的研究中，Melo等[22]发现细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）在胰腺癌患者血液外泌体中含量丰富，患者血清外泌体中GPC1能够以100%的准确率和敏感性诊断出早期胰腺癌。通过对急性中风性患者及正常人进行对比分析发现血清外泌体miR-9和miR-124的水平有希望作为生物标志物用于急性缺血性中风患者的诊断和缺血性损伤程度的评估[23]。DNM3、p65和p53在原始和复发性多形性胶质母细胞瘤患者的脑和血液外泌体中都有类似的改变趋势，可以作为多形性胶质母细胞瘤的潜在临床诊断标记[24]。多发性骨髓瘤患者血清外泌体中携带的miRNA中的两个，即let-7b和miR-18a，在单变量分析中与无进展生存期和总生存期显著相关，因此let-7b和miR-18a可以作为多发性骨髓瘤疾病的分子标志物[25]。以外泌体为基础的诊断使得在癌症病情发展过程中可及时监测分子标志物的变化，这种基于血液样本的检测比重复的组织活检更容易收集样本，更易监控疾病的进展。

2.3 作為药物传输的载体

外泌体表面表达各种粘连蛋白（跨膜蛋白和整合素）能够促进膜的相互作用和膜融合。用PEG-AA载体修饰装载有紫杉醇的外泌体[26]，将改善药物在血液中的循环时间并能够靶向肺转移的肿瘤细胞。Dong等[27]发现来自正常人的血清和肌管细胞的外泌体能够携带（dysferlin，DYSF）蛋白到达DYSF敲除的小鼠细胞中，为蛋白缺陷或缺失造成的病症提供了新的治疗策略。利用间充质干细胞的归巢能力，同时工程化修饰细胞分泌富含miR-379的胞外囊泡，作为转移性乳腺癌的创新疗法[28]。细胞外囊泡被嵌入到植入式生物材料中[29]，旨在利用酶前体药物疗法实现局部治疗的药物递送。基于RNA的疗法，将抗体样（即Y形状）RNA纳米颗粒附着到微泡上可以有效地将RNA治疗剂特异性地递送给癌细胞[30]。外泌体作为具有生物活性的在细胞间进行物质传递的系统，具有成为治疗药物载体的巨大潜力。

3 展望

在正常生理过程中外泌体发挥着介导细胞间通讯的重要功能[31]，它们也能够调节宿主-病原体的相互作用[32]，参与传染性疾病、炎性疾病、神经疾病和癌症等多种疾病的病理过程，可作为干预及治疗的潜在新靶点。随着对外泌体研究的深入，外泌体在临床医学中有十分光明的应用前景，主要是因为它们携带有核酸和蛋白，有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、疾病进展、治疗反应等。同时由于它们具有递送生物分子的功能，可作为理想的药物传递载体，通过将分子包裹在胞膜内，可以保护酶或者RNA免于降解，并通过细胞内吞作用来促进细胞摄取。在再生医学应用方面，与干细胞相比，外泌体体积更小，复杂性更低，易于生产和存储，甚至更容易避免干细胞研究应用面临的一些监管问题，同时干细胞外泌体不存在形成肿瘤的风险。此外，由于膜结合蛋白含量较低，外泌体的免疫原性低于干细胞。相信在不远的将来，基于外泌体本身的生理及病理功能可将外泌体应用于疾病的诊断与治疗，为患者带来福音。目前，外泌体的功能还没有完全阐明，外泌体内携带的蛋白与核酸具有不确定性，外泌体与受体细胞的相互作用方式仍然不明确，这一系列问题都有待于科研人员的进一步探索。

[参考文献]

[1] Pan BT，Johnstone RM. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro：selective externalization of the receptor [J]. Cell，1983，33（3）：967-978.

[2] Harding C，Heuser J，Stahl P. Receptor-mediated Endocytosis of Transferrin and recycling of the Transferrin Receptor in Rat Reticulocytes [J]. J Cell Biol，1983，97（2）：329-339.

[3] Johnstone RM，Adam M，Hammond JR. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles（exosomes）[J]. J Biol Chem，1987，262（19）：9412-9420.

[4] Zitvogel L，Lozier A，Lozier A，et al. Eradication of established nurine tumors using a novel cell-free vacine：dendritic-cell derived exosomes [J]. Nat Med，1998，4（5）：594-600.

[5] Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al. B lymphocytes Secrete Antigen-presenting vesicles [J]. J Exp Med，1996， 183（3）：1161-1172.

[6] Valadi H，Ekstrom K，Bossios A，et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells [J]. Nat Cell Biol，2007， 9（6）：654-659.

[7] Raposo G，Stoorvogel W. Extracellular vesicles：exosomes，microvesicles，and friends [J]. J Cell Biol，2013，200（4）：373-383.

[8] Shao H，Im H，Castro CM，et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles [J]. Chem Rev，2018， 118（4）：1917-1950.

[9] Li P，Kaslan M，Lee SH，et al. Progress in Exosome Isolation Techniques [J]. Theranostics，2017，7（3）：789-804.

[10] Lotvall J，Hill AF，Hochberg F，et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions：a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles [J]. J Extracell Vesicles，2014，3：26913.

[11] Colombo M，Moita C，van Niel G，et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis，composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles [J]. J Cell Sci，2013，126（Pt 24）：5553-5565.

[12] Dragovic RA，Gardiner C，Brooks AS，et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis [J]. Nanomedicine，2011，7（6）：780-788.

[13] Gardiner C，Ferreira YJ，Dragovic RA，et al. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis [J]. J Extracell Vesicles，2013，2.

[14] Baietti MF，Zhang Z，Mortier E，et al. Syndecan-syntenin-ALIX regulates the biogenesis of exosomes [J]. Nat Cell Biol，2012，14（7）：677-685.

[15] Théry C，Amigorena S，Raposo G，et al. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids [J]. Curr Protoc Cell Biol，2006.

[16] Cosenza S，Toupet K，Maumus M，et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes are more immunosuppressive than microparticles in inflammatory arthritis [J]. Theranostics，2018，8（5）：1399-1410.

[17] Silva AM，Almeida MI，Teixeira JH，et al. Dendritic Cell-derived Extracellular Vesicles mediate Mesenchymal Stem/Stromal Cell recruitment [J]. Sci Rep，2017，7（1）：1667.

[18] Siravegna G，Marsoni S，Siena S，et al. Integrating liquid biopsies into the management of cancer [J]. Nat Rev Clin Oncol，2017，14（9）：531-548.

[19] Luga V，Zhang L，Viloria-Petit AM，et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration [J]. Cell，2012，151（7）：1542-1556.

[20] Shan Y，You B，Shi S，et al. Hypoxia-Induced Matrix Metalloproteinase-13 Expression in Exosomes from Nasopharyngeal Carcinoma Enhances Metastases [J]. Cell Death Dis，2018，9（3）：382.

[21] Bliss SA，Sinha G，Sandiford OA，et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Stimulate Cycling Quiescence and Early Breast Cancer Dormancy in Bone Marrow [J]. Cancer Res，2016，76（19）：5832-5844.

[22] Melo SA，Luecke LB，Kahlert C，et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer [J]. Nature，2015，523（7559）：177-182.

[23] Ji Q，Ji Y，Peng J，et al. Increased Brain-Specific MiR-9 and MiR-124 in the Serum Exosomes of Acute Ischemic Stroke Patients [J]. PLoS One，2016，11（9）：e0163645.

[24] Yang JK，Song J，Huo HR，et al. DNM3，p65 and p53 from exosomes represent potential clinical diagnosis markers for glioblastoma multiforme [J]. Ther Adv Med Oncol，2017，9（12）：741-754.

[25] Manier S，Liu CJ，Avet-Loiseau H，et al. Prognostic role of circulating exosomal miRNAs in multiple myeloma [J]. Blood，2017，129（17）：2429-2436.

[26] Kim MS，Haney MJ，Zhao Y，et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases：in vitro and in vivo evaluations [J]. Nanomedicine，2018，14（1）：195-204.

[27] Dong X，Gao X，Dai Y，et al. Serum exosomes can restore cellular function in vitro and be used for diagnosis in dysferlinopathy [J]. Theranostics，2018，8（5）：1243-1255.

[28] O′brien KP，Khan S，Gilligan KE，et al. Employing mesenchymal stem cells to support tumor-targeted delivery of extracellular vesicle （EV）-encapsulated microRNA-379 [J]. Oncogene，2018，37（16）：2137-2149.

[29] Fuhrmann G，Chandrawati R，Parmar PA，et al. Engineering Extracellular Vesicles with the Tools of Enzyme Prodrug Therapy [J]. Adv Mater，2018，30（15）：e1706616.

[30] Pi F，Binzel DW，Lee TJ，et al. Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression [J]. Nat Nanotechnol，2018，13（1）：82-89.

[31] van Niel G，D′Angelo G，Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2018，19（4）：213-228.

[32] Zhang W，Jiang X，Bao J，et al. Exosomes in Pathogen Infections：A Bridge to Deliver Molecules and Link Functions [J]. Front Immunol，2018，9：90.

（收稿日期：2018-04-28 本文編辑：封 华）