GHK三肽的最新研究进展

张凤龙，高恩，杨小琳，赵金礼

摘 要：GHK（glycyl-L-histidyl-L-lysine）存在于人的血液、唾液、尿液当中并随着年龄的增长下降。通常GHK是与2价铜离子作为复合物来发挥促愈合和修复的功能。GHK可以调节胶原和糖胺聚糖的合成与分解，并且调节金属蛋白酶和它的抑制剂的活性。它刺激胶原、硫酸皮肤塑、硫酸几丁质、小糖蛋白、糖蛋白的合成，它同样能够恢复经过放化疗的成纤维细胞的再生能力。这种分子可以吸引免疫细胞和内皮细胞向受伤部位迁移。它加速皮肤、毛囊、胃肠道、骨组织，和狗的脚垫伤口愈合，它同样可以诱导大鼠、小鼠和豬的全身伤口愈合。在美容产品当中，它能够让松弛的皮肤紧实，并增加弹性，皮肤的密度和坚实度，减少细纹和皱纹，减少光损伤和色素沉着，增加角质形成细胞的增殖。已经证明GHK可以作为治疗性成分在慢性阻塞性肺炎和代谢性癌症中应用。GHK可以上调或者下调至少4000种人类基因，尤其在DNA恢复重建当中发挥重要作用。文章主要关注GHK在皮肤再生领域的最新进展。

关键词：GHK；GHK-Cu；铜肽；TGF-？茁 信号途径

中图分类号：Q51 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）06-0001-04

Abstract： GHK （glycyl-L-histidyl-L-lysine） is present in human blood， saliva and urine and decreases with age. In general， GHK acts as a complex with bivalent copper ions to promote healing and repair. GHK regulates the synthesis and decomposition of collagen and glycosaminoglycan， and the activity of metalloproteinases and its inhibitors. It stimulates the synthesis of collagen， sulphuric acid skin plastic， chitin sulfate， glycoprotein and glycoprotein， and it can also restore the regeneration ability of fibroblasts after radiotherapy and chemotherapy. This molecule can attract immune cells and endothelial cells to move to the injured site. It speeds the healing of skin， hair follicles， gastrointestinal tract， bone tissue， and dog foot pads. It also induces the healing of whole body wounds in rats， mice and pigs. In beauty products， it compacts the loose skin and increases elasticity， density and firmness of the skin， reduces fine lines and wrinkles， reduces light damage， and pigmentation， and increases the proliferation of keratinocytes. It has been shown that GHK can be used as a therapeutic component in chronic obstructive pneumonia and metabolic cancer. GHK can up-regulate or down-regulate at least 4，000 human genes， especially in the recovery and reconstruction of DNA. This review focuses on the latest development of GHK in the field of skin regeneration.

Keywords： GHK； GHK-Cu； copper peptide； TGF-？茁 signaling pathway

引言

GHK是一个三肽分子，序列是glycyl-histidyl-lysine。它自然存在于人的血液、唾液和尿液当中。20岁的时候GHK在血液当中的浓度是200ng/mL（10-7M），到了60岁的时候浓度降到80ng/mL。这种下降现象是与人的器官再生能力显著下降直接相关的。1973 年 Pickart首先分离到了GHK-Cu，它是在研究对老化组织和年轻组织同样起作用的活性物质中发现的三肽物质，接下来的研究证明这种三肽的序列是glycyl-L-histidyl-L-lysine，并且与铜离子有很强的亲和力，形成GHK-Cu复合物。研究证明GHK是以与铜离子形成复合物的形式发挥功能。

Pickart et al.等已经证明GHK-Cu加速伤口愈合和收缩，提高机体接受移植皮肤的接受能力，并且能够发挥抗炎的功能。Borel 和Maquart et al随后的研究证明GHK-Cu在非常低的浓度（1-10 nanomolar）范围内可以刺激和破坏胶原与糖胺聚糖的合成[6]。GHK调节金属蛋白酶及其抑制因子（TIMP-1 and TIMP-2）的活性，作为伤口愈合和皮肤再生的重要调节因子[7，8]。GHK-Cu激活胶原、硫酸皮肤素、硫酸几丁质和小分子糖蛋白、糖蛋白的合成。2001年McCormack等证明病人在接受放疗和化疗之后，DNA受到损伤的成纤维细胞可以重新恢复再生能力[10]。GHK同样可以吸引免疫细胞和内皮细胞向伤口处迁移。

GHK-Cu促进伤口愈合的能力已经通过非常多的动物实验证明，在兔子实验中GHK-Cu可以加速伤口的愈合并且促进新生血管生成，使血液中抗氧化酶的含量提高。这种分子也诱导大鼠、小鼠、猪的伤口愈合。在糖尿病大鼠的缺血性创面，促进愈合，降低TNF-alpha水平并促进胶原合成。它也能促进狗的脚垫伤口愈合。这些皮肤再生的文献扩大了GHK在美容行业的应用。

近年来GHK-Cu在治疗慢性阻塞性肺病、皮肤炎症、代谢性结肠癌等病症中作为治疗性成分广为宣传。据文献证明，它可以上调或者下调近4000种人类基因，并且它可以让DNA回复到一种更为健康的状态。这些研究为皮肤重塑提供了崭新的思路。

1 GHK-Cu的生物化学

X射线晶体学、电子顺磁共振谱、X射线吸收光谱、PMR光谱学以及滴定等方法已经对GHK-Cu的分子结构做了深入的研究。在GHK-Cu复合物中，铜离子与组氨酸侧链的咪唑环上的N原子互作，另外的N原子来自甘氨酸的 -氨基以及glycine-histidine肽键之间去质子化的酰胺氮（Figure 1）。

Lau and Sarkar等研究发现在生理条件下GHK-Cu复合物可以形成二元或者三元结构，这种结构包括组氨酸和人血白蛋白的Cu结合区。他们也发现可以很容易的获得Cu离子并结合到人血白蛋白的铜转运位点。已经证明结合到GHK三肽上的Cu离子的氧化还原特性是沉默的，这样进入细胞的Cu离子对细胞来说就是安全的[1]。

对于GHK来说最大的特点是与Cu离子形成复合物，这是非常重要的，因为人体内和皮肤上有很多重要的酶需要Cu离子，这些酶在结缔组织形成、抗氧化防御、细胞呼吸中发挥作用。Cu离子同时也发挥信号功能，能够影响细胞的行为和代谢。例如足够多的Cu离子是干细胞增殖和组织修复的信号。GHK也帮助降低自由态的Cu离子浓度，防止氧化损伤。

除了与Cu离子结合，GHK也可以中和毒素，尤其是那些在脂质过氧化过程中产生的毒素，GHK是一种非常高效的抗氧化剂。

最后GHK能作为细胞粘附分子，能帮助细胞粘附到细胞外基质中，帮助细胞迁移、增殖、分化、修复皮肤细胞。

2 GHK与TGF-？茁 信号途径

波士顿科学家和格罗宁根大学、英国大学、哥伦比亚大学和宾夕法尼亚大学的科学家发现GHK可以逆转COPD疾病的基因表达。COPD的病征表现为肺气肿、炎症，肺组织破坏，肺容量显著减少。

研究人员确定了127个基因的表达，这些基因与肺气肿严重程度密切相关。

COPD患者的这些基因表达上调，是参与炎症的基因，而组织重塑和修复相关基因的表达明显下调。这些活性下调的基因与TGF-？茁信号途径密切相关，一个由布罗德研究所开发的软件基因分析工具：基因连通图。研究人员利用这个工具发现GHK分子逆转了肺气肿销毁相关基因的表达。非常特别的是COPD病人的TGF-？茁信号途径关联基因活性下降。GHK逆转了这些基因的表达也可以说GHK激活了TGF-？茁途径。

体外研究已经证实用GHK处理的肺成纤维细胞能够逆转由TGF-？茁活性导致的负影响。有研究证明COPD病人的肺成纤维细胞有某些缺陷，这些缺陷与胶原的吸收与重建相关。当这样的细胞用GHK或者TGF-beta处理，胶原胶体的吸收和重建能力与健康细胞相当。而且这些细胞可以将胶原胶体变成胶原纤维。这些细胞的整合素beta 1基因表达提高。这些研究提示GHK 或许是通过调节TGF-beta途径基因表达的机制来提高组织再生能力[2]。

众所周知，皮肤再生需要大量的细胞因子和生长因子参与，这些因子共同合作，相互影响，构成了细胞内不同的信号途径。例如TGF-beta途径和整合素途径貌似是相互关联的。

COPD的研究证明，组织再生过程中这两个途径是被激活的，尽管GHK在这过程中的确切作用还有待证明。GHK能够使细胞恢复到更为健康的状态已经是毋庸置疑的。其作用的本质是激活或者抑制细胞内的各种信号传导途径。

3 GHK与癌症代谢基因以及皮肤重塑

Hong等人采用基因组数据鉴定容易引发结肠癌的生物标志物和调节它们表达的相关因子。在筛选了1309种生物活性物之后，只有两种能有效下调代谢基因的表达——GHK和生物碱。

在恶性代谢形式的结肠癌患者中GHK抑制了54个过表达基因当中的70%转录合成[3]。而且GHK是在1微摩尔浓度的情况下发挥作用，并且没有毒性。相对应的生物碱发挥作用是18微摩尔。作者指出GHK和生物碱都是大众知晓的皮肤重塑成分。而生物碱是非洲与中国治疗皮肤损伤的经典用药，它可以激活巨噬细胞[25]。受到GHK作用的54个基因包括YWHAB，MAP3K5，LMNA，APP，GNAQ，F3，FATC2，and TGM2，所有这些分子都是通过一种复杂的分子网络来发挥多种调节功能。

GHK在恶性代谢性结肠癌中的作用证明，GHK能够在基因水平调节各种生活途径，并且它似乎能够重构基因的活性，并使其恢复到健康状态，并以组织修复的形式表现出来。

Matalka等人的体外实验发现，当三种结肠癌细胞系与1 to 10 纳摩尔 GHK共同孵育时，细胞凋亡激活并且细胞生长受到抑制。

Pickart等人使用广泛的研究数据，发现了GHK诱导多种半胱天冬酶的抗癌表达，共同使用抗坏血酸和GHK-Cu强烈抑制生长在小鼠上的sarcoma-180。

4 GHK与皮肤干细胞再生

皮肤再生依赖于皮肤干细胞的生存能力和增殖能力。皮肤增生始于基底部附着在基底膜上的角化细胞。当细胞離开基底膜就开始进行终端分化。干细胞有无限的自我更新能力，然而他们的增殖潜力随着年龄的增长逐年下降。GHK-Cu在0.1-10micromolar的浓度可以提高表皮干细胞中的标记物例如整合素和基底层角化细胞中的标志物p63的表达，根据作者的表述，这些分子是基底层角化细胞干细胞活性提高的标志。因此整合素和p63或许是GHK调节皮肤再生的相关靶点。

近期的研究已经证实，人的干细胞用GHK凝胶预处理可以提高促血管生成因子的比如VEGF、bFGF等的分泌，并且是剂量依赖模式。当干细胞用抗整合素抗体处理时，以上情况不再发生，暗示GHK在干细胞上的作用是通过整合素信号途径发生的[4]。

5 GHK和IL-6在皮肤修复中的作用

伤口愈合和皮肤再生包括抗炎反应、细胞增殖、细胞迁移和基质重塑等。过度的炎症反应会延迟伤口的愈合并导致疤痕的形成。在正常人的牙成纤维细胞中，铜肽复合物GGH、GHK等可以减少TNF-alpha诱导的IL-6的分泌。而其他的铜复合物无此作用。研究者推断GHK和GHK-Cu可以作为替代糖皮质激素的抗炎剂使用。

6 GHK与DNA 损伤修复

GHK能够恢复受辐射的成纤维细胞的活力。研究者用来自暴露于辐射环境（5000rad）的颈部成纤维细胞，把GHK（10-9M）加入到无血清培养基中。对照组不加GHK。在对照组中尽管细胞可以存活并且繁殖，但它们的生长曲线与正常细胞完全不同。受辐射细胞在24h和48h的检测中与正常细胞相比生长延迟。而用GHK处理的辐射细胞生长得更快（表现与正常细胞相似）。此外GHK处理过的细胞产生了更多的生长因子，这些因子对于伤口愈合非常重要。

成纤维细胞是伤口愈合和组织再生的主要细胞。它们不仅合成细胞外基质的各种成分，也产生大量的生长因子（这些因子调节细胞的迁移和增殖、血管生成、上皮化等等）。辐射损伤细胞的DNA，进而损伤细胞功能。既然GHK可以恢复受辐射细胞的功能，我们有理由相信GHK有修复受损DNA的能力。

采用布罗德研究所开发的软件基因分析工具：基因连通图研究GHK发现：GHK可以提高与DNA損伤修复行管的47个基因的表达并下调5个基因的表达。

7 GHK-Cu的临床应用

大量的临床研究实验发现GHK-Cu可以提高50岁左右女性的皮肤质量以胶原蛋白的产生为评价标准检，方法是活检样本的免疫组化。实验过程如下，当在大腿上使用GHK-Cu霜剂一个月以后，GHK-Cu具有明显的促胶原合成效果。GHK-Cu对70%的女性有效果，vitamin C对50%的女性有效果，维甲酸对40%的女性有效果。

71名面部皮肤轻度或重度老化的女性使用GHK-Cu面霜12周后，皮肤老化明显改善。GHK-Cu改善皮肤松弛，清晰度和外观，减少细纹和皱纹的深度，皮肤密度和厚度增加。

41名面部皮肤轻度或重度老化的女性使用GHK-Cu眼霜12周后，与使用维生素K的对照组相比，GHK-Cu在抗皱方面效果明显，皮肤密度和厚度增加。

在另外一组实验中，61名年龄在50到59岁之间的女性每天使用GHK-Cu面霜两次，皮肤紧实度清晰度提高，细纹减少，粗糙度减少，色素沉着改善，皮肤密度和厚度增加。

组化学活检分析结果显示这种面霜可以刺激皮肤角质化细胞增生。

这些实验的结果可以证明GHK-Cu面霜有如下效果：

（1）皮肤紧实，提高弹性。（2）提高皮肤密度和韧性。（3）减少细纹和深纹。（4）提高亮度。（5）减少色素沉着和斑点。（6）显著提高角质细胞增生。

8 剂型与吸收机制

GHK-Cu能够穿过角质层，并且在数量上足以激活再生。随着pH的提高渗透率提高。研究证明GHK和GHK-Cu可以穿过角质层，然而由于易酶解，确保有足够多的铜肽吸收就非常重要。Arul等人采用生物素化的铜肽与胶原基质结合的方式处理真皮伤口，他们的研究发现GHK-Cu改善伤口收缩并且提高了细胞的增殖以及抗氧化酶的表达。

近期的研究已经考察了GHK-Cu的稳定条件：在氧化条件下易于水解，在水中或者是pH 4.5-7.4 的缓冲液中，60℃条件下可以保存两周。辛醇-磷酸盐缓冲盐水中的分配系数表明GHK-Cu是高度亲水性，对带负电荷的脂质二乙酰磷酸条件下不太稳定。

以羟丙基纤维素为包衣的GHK-Cu微球作为结肠定位释放药物使用。GHK-Cu的释放受交联程度以及药物载量的影响，这种微球在4小时内释放50-80%的药物。这些研究提示GHK-Cu可以作为膳食补充剂使用。

9 GHK-Cu复合物的抗分解作用

处理皮肤伤口和溃疡的主要难题是感染。伤口上的细菌会分泌蛋白酶分解GHK和其他促愈合的细胞因子。GHK本身就是在蛋白质分解过程中产生的一大群小肽混合物的一份子。当我们在小肽混合物中加入铜离子时，我们发现小肽混合物有很好的促愈合活性，而且这样的肽不会被进一步分解，对酶有抵抗作用。

Howard Maibach's研究组后来在四种人类伤口愈合系统中验证了GHK-Cu的活性。

这些皮肤创伤模型包括：

（1）丙酮清除皮肤脂质。（2）月桂酸钠强刺激皮肤。（3）胶带剥脱术对皮肤的刺激。（4）激活患者对镍过敏的反应。

10 GHK：一种天然的真皮修复调节剂

皮肤中伤口的愈合经历了以下阶段：止血、炎症反应、造粒、疤痕重建。每个阶段都需要协调细胞相互作用，因此不同来源的大量的生物活性分子作为协调员来引导细胞完成整个过程。例如受伤后立即脱粒，血小板释放生长因子调动免疫细胞到受伤的位置。

角化细胞和成纤维细胞也会产生大量的细胞因子，中性粒细胞、巨噬细胞和其他被征召到受伤部位的免疫细胞生产相应的细胞因子。

GHK是人类蛋白质中罕见的序列；然而，它在细胞外基质的蛋白质中更为常见（ECM）。GHK是一型胶原 2链中的组成部分，受伤时蛋白酶分解胶原将GHK释放到伤口部分。另外一个含有GHK的非常有名的糖蛋白是SPARC，它在受伤后分解生成GHK-Cu[56]。蛋白质水解或者说细胞外基质水解后释放了一系列重要的调控分子，称为细胞外基质活化素。这些分子激活或者调控真皮修复过程。既然GHK作为受伤后在细胞外基质中存在的多肽序列，那么可以认为它是一种天然的真皮修复剂。

11 結束语

长期以来人们已经认识到铜结合肽GHK-Cu有加速伤口愈合，激活皮肤再生等功能。GHK-Cu与真皮修复和皮肤再生有关的信号途径分子组成了一个完善的调控网络，这些分子之间互相发生作用。当这种互作中断了，伤口愈合的进程就延迟了，从而导致过度的炎症反应和疤痕的形成。GHK能够重新恢复真皮组织中细胞信号途径的最佳状态，并且基因被恢复到更为健康的状态。

参考文献：

[1]Choi H.-R.， Kang Y.-A.， Ryoo S.-J.， et al. Stem cell recovering effect of copper-free GHK in skin. Journal of Peptide Science. 2012，18（11）：685-690. doi： 10.1002/psc.2455.

[2]Jose S.， Hughbanks M. L.， Binder B. Y. K.， Ingavle G. C.， Leach J. K. Enhanced trophic factor secretion by mesenchymal stem/stromal cells with Glycine-Histidine-Lysine （GHK）-modified alginate hydrogels. Acta Biomaterialia. 2014，10（5）：1955-1964. doi： 10.1016/j.actbio.2014.01.020.

[3]Pollard J. D.， Quan S.， Kang T.， Koch R. J. Effects of copper tripeptide on the growth and expression of growth factors by normal and irradiated fibroblasts. Archives of Facial Plastic Surgery. 2005，7（1）：27-31. doi： 10.1001/archfaci.7.1.27.

[4]Leyden J.， Stephens T.， Finkey M.， Barkovic S. Skin Care Benefits of Copper Peptide Containing Eye Creams. University of Pennsylvania，2002.