助阳开郁方对抑郁症大鼠海马BDNF表达及其胞内信号转导通路的影响

冯振宇，赵 杰，马小娟，王虹娟，陈佳丽

（山西中医学院中西医结合医院，山西太原030013）

抑郁症是一种严重危害人类身心健康的精神疾病，其终生患病率高达15%～20%，并且呈慢性及反复发作性等特点，严重影响患者的生活质量［1-2］。目前，关于抑郁症的发病机制尚未完全阐明。大量研究证实，海马神经突触结构损伤和神经元再生障碍等神经可塑性的改变是抑郁症发病的关键环节，脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元的生长与突触的形成方面起到了重要作用，具有调控神经突触可塑性的效应，在抑郁症发生与病理过程中的作用已得到了广泛关注。海马内环磷酸腺苷（cAMP）-cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路-脑源性神经营养因子（BDNF）信号通路是BDNF调控海马神经元可塑性的重要胞内转导机制［3］。目前，调节诱导海马BDNF及其信号转导通路，已经成为抗抑郁药物研究和开发的一个热点。

助阳开郁方由“甘麦大枣汤”合清末郑钦安的“补坎益离丹”加减化裁而成，其作为临床验方应用于抑郁症已有十余年，在前期的临床疗效评价研究中发现，本方可以通过调整抑郁症患者5-羟色胺、去甲肾上腺素水平干预阳虚型抑郁症患者神经内分泌系统发挥治疗作用。课题组通过建立应激抑郁动物模型，观察到本方能够有效改善抑郁症大鼠行为学表现，并对调节海马神经可塑性具有一定的作用。本研究选择BDNF及其关键的胞内信号转导通路cAMP-CREB-BDNF通路进行研究，以期进一步探讨助阳开郁方抗应激抑郁的作用机制。

1 实验与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物 助阳开郁方由炮附子15 g，蛤粉 20 g，牡蛎 30 g，桂枝 15 g，砂仁 10 g，炒黄柏10 g，茯苓20 g，炙甘草10 g组成，饮片购自山西中西医结合医院药房。按原方比例称取药材，先浸泡30 min，附子单独浸泡并先煎60 min再与其余药物共煎20 min，反复煎煮3次，混合药汁，至稠膏状，60℃烘干制成干膏并粉碎成细粉，过80目筛。盐酸氟西汀分散片（西班牙礼来公司，批号：A496002，规格20 mg/片），助阳开郁方各剂量与盐酸氟西汀根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算配制成浓缩水溶液备用。

1.1.2 动物 无特定病原体SPF级雄性Wistar大鼠共 36 只，初始体重（165±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2012-0024］。

1.1.3 主要试剂 cAMP ELISA检测试剂盒（Elabscince 公司，批号：AK0015AUK18），组织 RNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物有限公司，批号202366AX），DNA逆转录试剂（北京艾德莱生物有限公司，批号267258AH），PCR扩增试剂（北京艾德莱生物有限公司，批号272632AX），内参βactin、CREB、BDNFmRNA特异性引物（武汉金开瑞生物工程有限公司设计）。

1.1.4 主要仪器 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），Synergy 4多功能微孔板检测仪（美国BioTek公司），Tc-xP基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），Scandrop 250超微量分光光度计（德国耶拿公司），JXFSTRP-24全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司），1316型生物安全柜（美国Thermo公司），MB-102恒温金属浴（杭州博日科技有限公司），Fresco17高速冷冻离心机（美国Thermo公司）。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组 将36只大鼠适应性饲养7 d，然后按随机数字表法分为空白组、模型组、助阳开郁方高、中、低剂量组，氟西汀组，每组6只。

1.2.2 造模及给药 参照文献方法［5］除正常组外，其余各组大鼠均给予慢性不可预知温和刺激刺激（CUMS）结合孤养造模，具体方法为：选用夹尾（1 min）、闪光（1 h）、噪音（1 h）、冰水游泳（4 ℃，5 min）、倾斜笼具（30 °，24 h）、潮湿垫料（100 mL，24 h）、昼夜颠倒、禁水、禁食9种温和刺激，于每日9：00和16：00随机安排刺激2次，连续刺激28 d。在造模的同时，空白组和模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液灌胃，助阳开郁方高、中、低剂量组分别灌胃助阳开郁方浓缩煎剂（剂量分别相当于生药11.7 g/kg、23.4 g/kg、46.8 g/kg），氟西汀组灌胃盐酸氟西汀（1.8 mg/kg），每只大鼠灌胃容量为0.2 mL/10 g，连续灌胃 28 d。

1.2.3 样本采集 于实验第29 d，采用3%戊巴比妥钠2 mL腹腔注射麻醉大鼠，然后断头处死，冰盘上迅速分离海马组织并置于液氮保存。

1.2.4 ELISA法检测大鼠海马cAMP含量 将海马组织于2℃～8℃复温，加入2 mL预冷的PBS缓冲液（pH 7.4），用自动研磨仪在液氮中研磨制作成匀浆，匀浆液以3 000 r/min低温离心20 min，收集上清，采用ELISA方法检测海马cAMP含量，检测过程中严格按照检测试剂盒的说明操作。

1.2.5 RT-PCR法检测海马组织CREB与BDNF mRNA的表达 用自动快速研磨仪将海马组织在液氮中研磨制作成组织匀浆。采用EASY spin Plus组织RNA快速提取试剂盒，按照其说明书提取总RNA并在液氮保存；采用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与A 260/A280的比值，比值在1.8～2.0之间方可进行下一步实验；每样取总RNA 1.5 μg与 Oligo（dT）18引物溶液 1 μL、5RT Reaction Mix 4 μL、TRuE script H-R Tase/RI 1 μL 混合合成cDNA，加入RNase free water定容到总体积20 μL，混匀后离心，42℃孵育40 min，85℃孵育5 min以失活TRuE script H-R Tase，放入4℃冰箱待扩增；建立以下扩增反应体系：2 SYBR qPCR Mix 12.5 μL、DNA Template 1 μL、Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，用 RNase free water定容到 25 μL；设置PCR 循环条件：94℃、3 min→94℃、10 s→60℃、34 s，共40个循环，以DEPC无菌水代替cDNA模板作为阴性对照，每样品 3个复孔，在每个循环延伸阶段收集荧光信号，分析融解曲线；制备1.5%的琼脂糖凝胶（含EB 1 g/L），取扩增后样品5 μL加入 1 μL的 6×Loading buffer混匀，然后加入点样孔，设定电泳条件为180 v，10 min开始电泳，电泳结束后在紫外透射模式下观察RNA电泳结果并拍照。荧光定量PCR结果首先分析溶解曲线，各样本的峰值基本一致，无杂峰信号，表示产物特异度高，以β-actin为内参，通过计算倍数变化2-ΔΔCt值，对目的基因进行相对定量分析，比较各组差异。PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，多组间两两比较采用Student-Newman-Keuls（SNK）-q 检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织cAMP含量的影响

与正常组比较，模型组海马cAMP含量显著减低（P＜0.05）；与模型组比较，助阳开郁方高剂量组、氟西汀组海马cAMP含量显著增加（P＜0.05），助阳开郁方中剂量组和低剂量组海马cAMP含量也呈下降趋势且呈量效关系，但差异无统计学意义（P＞0.05）；助阳开郁方高剂量组海马cAMP含量与氟西汀组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表见2。

表2 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织cAMP含量的影响 （±s）

表2 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织cAMP含量的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

助阳开郁方组 6氟西汀组 6 11.7 2.65±1.26 23.4 5.52±1.42 46.8 6.46±2.862）3.33×10-3 6.79±3.372）F 7.26 P＜0.01

2.2 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织CREB mRNA、BDNF mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组滑膜组织中CREB、BDNF mRNA 表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，助阳开郁方高剂量组和氟西汀组大鼠海马组织CREB、BDNF mRNA表达明显增高（P＜0.05）；与氟西汀组比较，助阳开郁方高剂量组CREB、BDNF mRNA表达较低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表 3、图1。

表3 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织BDNF、CREB mRNA表达的影响 （±s）

表3 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织BDNF、CREB mRNA表达的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05

组别 n 给药剂量（g/kg） CREB mRNA BDNF mRNA正常组 6 - 12.57±1.16 15.42±3.29模型组 6 - 6.03±1.462） 8.50±3.571）助阳开郁方组 6氟西汀组 6 11.7 7.99±2.03 10.52±3.32 23.4 9.18±2.74 11.27±6.60 46.8 10.96±3.023） 13.81±3.803）3.33×10-3 11.67±2.853） 14.72±2.633）F 6.76 2.64 P＜0.01 ＜0.05

图1 助阳开郁方对抑郁症大鼠海马组织CREB、BDNF mRNA表达的影响

3 讨论

抑郁症是一种以心境低落为主要特征的综合征［5］，有关抑郁症的发病机理至今尚未阐明，随着医学研究的不断深入，目前认为长期慢性应激是促发抑郁的重要因素［6］，大脑海马区是神经发生的主要结构，负责学习和记忆，慢性应激是引起海马结构损害和功能变化的重要因素［7］，海马神经突触结构损伤和神经元再生障碍等神经可塑性的改变可能是抑郁症发病的关键环节之一［8］。

BDNF作为一种具有神经营养作用的蛋白质，在神经元生存、生长以及突触的形成等方面起到了重要的作用，具备调控神经可塑性效应，主要分布于中枢神经系统，其中以海马和皮质中含量最高，BDNF的异常表达在抑郁症发病中的作用已获得广泛关注，而BDNF表达的增加有利于神经元的生存和形成，改善海马神经突触可塑性，这一机制被认为是各种抗抑郁剂治疗的共同作用途径［9］。BDNF调控海马神经元可塑性胞内转导机制为：AC将三磷酸腺苷转化为cAMP，cAMP激活蛋白激酶，并将CREB磷酸化，CREB-CRE结合，BDNF的启动子区内含CRE序列，受到CREB的调控，CREB磷酸化可增加体内BDNF的表达，BDNF与其受体TrkB结合后使细胞中的突触囊空泡素（SYN）、突触素Ⅰ、抗凋亡因子（BCL-2）及钙结合蛋白表达上升，SYNA和突触素Ⅰ可增强海马神经突触成熟及可塑性，BCL-2可降低海马神经元萎缩和凋亡［13］。长期的抗抑郁治疗可以上调cAMP-CERB通路［10］，然后进一步介导BDNF的功能增强［14］，通过给予cAMP降解酶磷酸二酯酶抑制剂2 w，可以使cAMP水平增加，调节cAMPCERB功能，增加海马组织磷酸化CERB（p-CERB）水平及BDNF的表达，促进神经元发生，此类药物抗抑郁作用已经得到广泛的证实［12］。

抑郁症主要表现为情绪低落、思维迟缓、主动性下降等，中医辨证机体阳气不足或阳气郁结，素体阳虚，或心、肝、脾、肾诸脏阳虚，阳虚升之不及，抑郁由此而生，温阳法治疗抑郁症切合抑郁症之病机，助阳开郁方可温肾暖脾，助阳舒肝，在治疗抑郁症方面有良效。本研究在前期研究成果的基础上进一步观察了助阳开郁方对抑郁症大鼠海马BDNF及其信号转导重要通路cAMP-CREB-BDNF通路的影响，结果发现CUMS大鼠海马BDNF、CREB表达及cAMP含量显著降低，中、高剂量助阳开郁方干预可显著上调大鼠海马组织BDNF、CREB mRNA表达水平，同时增高大鼠海马组织cAMP含量，表明助阳开郁方调节海马组织BDNF的表达及其cAMP-CREB-BDNF通路中信号分子的异常表达，这可能是改善抑郁大鼠的抑郁行为的重要机制之一。

抑郁症的发生与社会、心理、遗传等因素密切相关，病理生理变化多样而复杂，发病机制涉及神经内分泌和免疫系统等功能失调，但由于抑郁症发病机制尚不完全明确，而中药复方往往可从多环节、多层次、多靶点调节，因此对于抗抑郁中药方剂的作用机制还有待进一步深入探索。