助阳补肺除痹颗粒药效学实验研究

胡少丹，仕 丽，王 旭

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

间质性肺疾病（ILD）是一类主要累及肺间质与肺泡腔，导致肺泡毛细血管功能单位丧失的弥漫性肺疾病[1]，病变位置包括肺泡壁、细支气管等组织，继续发展最终会产生肺间质纤维化、蜂窝肺等不可逆病理改变[2]。临床表现主要有呼吸困难（呈进行性加重）、低氧血症、限制性通气功能障碍、弥散功能减低以及双肺弥漫性病变等[3]。王檀认为间质性肺疾病属于中医“肺痹”范畴，并根据多年教学及临床经验，创立助阳补肺汤治疗间质性肺疾病，效果显著[4-5]。助阳补肺除痹颗粒（长春中医药大学附属医院制剂中心制）是在阳和汤的基础上进行加减，主要成分包括鹿茸、熟地黄、当归、干姜、肉桂、补骨脂、人参、白术、茯苓、桃仁、红花、炙麻黄、炙甘草等，可益精助阳，除湿通痹，临床用于脾肾阳虚、湿滞痹阻所致的肺痹。本研究通过评价助阳补肺除痹颗粒抗炎、止咳及非特异性免疫功能等方面的作用，以期为临床合理用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF 级KM 小 鼠（18～20 g）、SPF 级ICR 小鼠、清洁级Wistar 大鼠（180～220 g）雌雄各半，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001；普通级豚鼠（250～350 g），雌雄各半，购自长春生物制品研究所有限责任公司，动物合格证号：SCXK（吉）2016-0008。

1.2 药品与试剂 助阳补肺除痹颗粒（规格：每袋10 g，人用量：每次10 g，每日3 次，由长春中医药大学附属医院制剂中心提供，生产批号：20170201），醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：1504132），伊文斯兰（上海楷洋生物技术有限公司，批号：S0039），氯化钠（分析纯，北京化工厂，批号：2017-01-09），乙酸（冰醋酸）（分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：1607131），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：E0913420），乙醚（分析纯，北京化工厂，批号：20161206），聚维酮碘溶液（吉林省明星医用消毒药械厂，批号：161023），消炎止咳片（吉林敖东集团大连药业股份有限公司，批号：170306），柠檬酸（分析纯，北京化工厂，批号：20160322），氨水（分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：1606161）。

1.3 仪器 紫外/可见分光光度计（型号：Lambda 25，美国Perkin Elmer 公司），贺利氏（Heraeus）台式离心机Stratos（型号：Biofuge Stratos，德国贺利氏公司），电子天平（型号：YP1201N，上海舜宇恒平科学仪器有限公司），电子天平（型号：JY2002，上海舜宇恒平科学仪器有限公司），SQP313 型（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），YLS-8A 多功能诱咳引喘仪（山东省医学科学院设备站）。

2 方法

2.1 抗炎实验

2.1.1 助阳补肺除痹颗粒对小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛细血管通透性的影响[6-8]取KM 小鼠50只，按体质量随机分为5组，依次为对照组、阳性对照药醋酸泼尼松（强的松）（10 mg·kg-1·d-1）组（给药剂量相当于临床每天使用量的2 倍）、助阳补肺除痹颗粒高、中、低剂量3组（18.84，9.42，4.71 g·kg-1·d-1），每组10 只。先预防性给药7 d，在末次给药后1 h，给各组小鼠均按0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1 mL/10 g体质量行静脉注射，每只给予腹腔注射0.6% Hac 溶液0.2 mL，于20 min 后处死小鼠，打开腹腔，以2 mL 注射器分3 次各抽取2 mL 生理盐水冲洗腹腔，吸出冲洗液。合并3 次冲洗液后加入生理盐水至10 mL。3 000 rpm离心15 min 后取上清液于590 nm 波长比色测定吸光度（OD值）。结果以均数±标准差（）表示，采用组间t检验统计数据。

2.1.2 助阳补肺除痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响[9-10]选用Wistar 大鼠50 只，清洁级，按体质量随机分为5组，依次为对照组、阳性对照药醋酸泼尼松（强的松）5 mg·kg-1·d-1组（约临床用药量的2 倍）、助阳补肺除痹颗粒设高剂量（9.28 g·kg-1·d-1）、中剂量（4.64 g·kg-1·d-1）和低剂量（2.32 g·kg-1·d-1）3 个给药剂量组，每组10 只。以15 mL·kg-1体质量给药，对照组给予同体积蒸馏水以便对照。

实验第1天，将各组大鼠在乙醚麻醉下胸部剔毛，用碘酒消毒后，于前胸正中开小口，约1 cm 长，取灭菌棉球2 个（每个棉球质量20 mg，高压灭菌，经浓度为10 mg·mL-1青霉素溶液浸透，烘干处理）分别植入皮下两侧腋窝处，缝合切口。

实验第2 天，按剂量将各组大鼠灌胃给药，连续给药7 d。于第8 天给药1 h 后处死大鼠，取出棉球及周围结缔组织，剔除周围脂肪，即得棉球肉芽肿。以电子天平获得其重量，除去棉球重量则获得肉芽肿湿重。将棉球肉芽肿在室温下放置24 h 后自然晾干，再以电子天平获得其重量，除去棉球重量则获得肉芽肿干重。以均数±标准差（）表示各组数据结果，用t检验统计组间差异的显著性检验。

2.1.3 助阳补肺除痹颗粒对博来霉素所致肺纤维化大鼠模型肺组织的影响[11]SPF 级Wistar 大鼠，按体质量随机分为6组，每组10 只。分别为假手术组，模型组，阳性对照药醋酸泼尼松（5 mg·kg-1·d-1）组，助阳通痹颗粒设高剂量（9.28 g·kg-1·d-1）、中剂量（4.64 g·kg-1·d-1）和低剂量（2.32 g·kg-1·d-1）3 个给药剂量组（以下简称中药高/中/低剂量组）。给药体积为15 mL·kg-1体质量，假手术组及模型组给予同体积蒸馏水。

以博来霉素诱导肺纤维化，建模后第2 天起各药物干预组大鼠分别灌胃给药，每日1 次。假手术组和肺纤维化模型组灌胃给予等体积蒸馏水。分别于造模后第7 天、第14 天和第28 天3 个时间点每组随机选取大鼠，剖取左侧肺组织标本交病理研究室进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson 三色染色做肺病理组织学检测。

2.2 止咳实验

2.2.1 助阳补肺除痹颗粒止咳试验（豚鼠枸橼酸喷雾引咳法）[12]选取50 只普通级豚鼠，雌雄各半，随机分为5组，分别为对照组、阳性对照药消炎止咳片（0.3 g·kg-1·d-1）组（相当于临床用药的2 倍）、助阳补肺除痹颗粒设高剂量（7.38 g·kg-1·d-1）、中剂量（3.69 g·kg-1·d-1）和低剂量（1.85 g·kg-1·d-1）3个给药剂量组（相当于临床用药的4 倍、2 倍和1 倍），每组10 只。先预防性灌胃给药7 d。末次给药后1 h，将实验豚鼠分别放置于YLS-8A 多功能诱咳引喘仪箱体内，喷雾17.5%枸橼酸溶液1 min 引咳，观察和记录豚鼠的咳嗽潜伏期（s）（从开始喷雾到豚鼠发出咳嗽声的时间），以及在5 min 内的咳嗽次数（以听到豚鼠洪亮的咳嗽声计算）。结果以均数±标准差（）表示，采用组间t检验统计。

2.2.2 助阳补肺除痹颗粒止咳试验（小鼠氨水引咳法）[13]将50 只SPF 级ICR 小鼠随机分为5组，分别为对照组，阳性对照药消炎止咳片0.76 g·kg-1·d-1组（相当于临床用药的2 倍），助阳补肺除痹颗粒设高剂量（18.84 g·kg-1·d-1）、中剂量（9.42 g·kg-1·d-1）和低剂量（4.71 g·kg-1·d-1）3个给药剂量组（相当于临床用药的4 倍、2 倍和1 倍），每组10 只。预防性给药7 d，每天灌胃给药1 次，于末次给药后1 h，分别将小鼠放入YLS-8A 多功能诱咳引喘仪箱体内，喷雾25%氢氧化氨溶液5 s 刺激引咳，观察并记录实验小鼠的咳嗽潜伏期（s），以及2 min内的咳嗽次数（以观察到小鼠剧烈收缩腹肌并张嘴为小鼠咳嗽的判断指征）。结果以均数±标准差（）表示，以组间t检验处理数据。

2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（）表示，多组数据进行单因素方差分析（One-way ANOVE），方差齐性时用最小显著性差异法（LSD）检验，方差不齐性时用Tamhane’s T2法检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 助阳补肺除痹颗粒抗炎作用

3.1.1 助阳补肺除痹颗粒对小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛细血管通透性的影响 实验结果表明，阳性对照（醋酸泼尼松）组与助阳补肺除痹颗粒高剂量组（18.84 g·kg-1·d-1）、中剂量组（9.42 g·kg-1·d-1）动物腹腔渗出液明显低于对照组（P＜0.01）；助阳补肺除痹颗粒低剂量组（4.71 g·kg-1·d-1）动物腹腔渗出液与对照组比较也显著性降低（P＜0.05），说明助阳补肺除痹颗粒可显著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高，改善急性炎症。见图1。

图1 助阳补肺除痹颗粒对小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛细血管通透性的影响

3.1.2 助阳补肺除痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响 实验结果表明，助阳补肺除痹颗粒高剂量组（9.28 g·kg-1·d-1）动物肉芽肿湿重和干重均明显低于对照组（P＜0.01）；阳性对照（醋酸泼尼松）组、助阳补肺除痹颗粒中剂量组（4.64 g·kg-1·d-1）和低剂量组（2.32 g·kg-1·d-1）动物肉芽肿湿重和干重也明显低于对照组（P＜0.05）。说明助阳补肺除痹颗粒对慢性炎症反应过程中的内芽组织增生具有很好的抑制作用。见表1。

表1 助阳补肺除痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响（） g

表1 助阳补肺除痹颗粒对大鼠棉球肉芽肿形成的影响（） g

注：与对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.1.3 助阳补肺除痹颗粒对博来霉素所致肺纤维化大鼠模型肺组织的影响 如图2，基于造模7 d、14 d、28 d 的大鼠肺组织病理，假手术组肺组织形态正常，结构清晰，偶有局部肺泡壁增厚，炎症细胞增生程度轻。模型组大鼠肺组织肺泡结构破坏已难以分辨，以大量炎症细胞及成纤维细胞浸润为主，肺纤维化改变明显。阳性对照组大鼠肺泡间隔增宽，以炎症细胞及成纤维细胞浸润为主，间有成纤维细胞增加，与模型组比较程度减少。中药组大鼠肺组织结构较为清晰，与模型组相比，中剂量（4.64 g·kg-1·d-1）和低剂量（2.32 g·kg-1·d-1）组的肺泡炎症和纤维化程度在不同程度上均有所减轻，高剂量（9.28 g·kg-1·d-1）组效果尤为显著。

图2 造模7 d、14 d、28 d 时观察各组大鼠肺组织病理学改变

3.2 助阳补肺除痹颗粒止咳作用

3.2.1 助阳补肺除痹颗粒止咳试验 本实验中，助阳补肺除痹颗粒各给药剂量组和阳性对照组动物的咳嗽潜伏期均较对照组明显延长（P＜0.05，P＜0.01），咳嗽次数均较对照组明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。实验结果表明，助阳补肺除痹颗粒对枸橼酸诱发的豚鼠咳嗽具有明显的抑制作用。其机制可能是通过相关的化学感受器发挥作用，抑制支气管黏膜对刺激的反应性而发挥出外周性镇咳作用。见表2。

表2 助阳补肺除痹颗粒对豚鼠枸橼酸喷雾引咳的影响（）

表2 助阳补肺除痹颗粒对豚鼠枸橼酸喷雾引咳的影响（）

注：与对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.2.2 助阳补肺除痹颗粒止咳试验 实验结果表明，助阳补肺除痹颗粒高剂量（18.84 g·kg-1·d-1）组、中剂量（9.42 g·kg-1·d-1）组、低剂量（4.71 g·kg-1·d-1）组3 个给药剂量组和阳性对照药组（0.76 g·kg-1·d-1）动物的咳嗽出现的潜伏期均较对照组明显延长，且咳嗽次数明显减少（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。说明助阳补肺除痹颗粒可明显抑制氨水刺激引发的咳嗽，具有明显的止咳作用。见表3。

表3 助阳补肺除痹颗粒对小鼠氨水引咳的影响（）

表3 助阳补肺除痹颗粒对小鼠氨水引咳的影响（）

注：与对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001

4 讨论

炎症是活体组织对内外环境有害刺激所产生的一种复杂生理、病理的防御反应。早期炎症因炎症介质刺激，血管扩张，血管内皮细胞间隙增宽，血管壁通透性提高，炎症局部组织血管内的液体和细胞成分通过血管壁进入组织间质、体腔和黏膜表面，造成组织肿胀。因此，炎性渗出是急性炎症早期的重要指标。本试验通过冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高动物模型，证实助阳补肺除痹颗粒可显著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高，改善急性炎症。

慢性炎症增殖期是以组织变性和纤维化为特征。灭菌棉球是机体的物理性致炎因子，埋入大鼠局部皮下，刺激局部组织细胞分裂增殖，可导致与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生，模拟慢性炎症的发生[14]。本试验采用大鼠腋部皮下植入棉球肉芽肿试验观察，评价了助阳补肺除痹颗粒对炎症晚期肉芽组织增生的抑制作用。

镇咳药的药理作用机制主要分为中枢性和外周性两类。枸橼酸诱发的豚鼠咳嗽反应通过C 纤维释放递质引起咳嗽反射和支气管收缩反应，可归类为外周性咳嗽模型[15]。本试验采用枸橼酸溶液喷雾引咳法，刺激豚鼠呼吸道黏膜感受器，反射性引起咳嗽，证实助阳补肺除痹颗粒对枸橼酸诱发的豚鼠咳嗽具有明显的抑制作用。其机制可能是通过相关的化学感受器发挥作用，对支气管黏膜对刺激的反应性起到抑制作用而发挥出外周性镇咳作用。

动物吸入浓氨水后，因刺激性臭味强烈可刺激呼吸道黏膜而诱发咳嗽。本试验采用浓氨水喷雾法使小鼠吸入氨水气雾后，刺激呼吸道黏膜感受器，反射性引起咳嗽。以此方法观察、评价了助阳补肺除痹颗粒的止咳作用。

综上所述，助阳补肺除痹颗粒有抗炎、止咳作用，具有良好的开发和应用前景。本研究结果为助阳补肺除痹颗粒的临床应用提供了实验依据，作用机制方面还有待进一步探讨。