高效液相色谱—原子荧光光谱法测定护肤膏霜中砷形态

施煜 郑增尧 黄文水 郑曼冰

【摘 要】建立高效液相色谱-原子荧光光谱法（HPLC-AFS）测定护肤膏酸中4 种砷形态[亚砷酸盐As（Ⅲ）、砷酸盐As（Ⅴ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）]的方法。样品用硝酸溶液超声提取后，用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱分离，以15mmol/L磷酸氢二胺溶液为流动相，等度洗脱，后经原子荧光测定各组分含量。优化后原子荧光的条件：硼氢化钾浓度为20g/L（含5g/L NaOH），载流为体积分数 5%的盐酸。方法的线性范围为0～100μg/L，线性相关系数大于0.9990，4 种砷形态的检出限为0.025～0.029μg/L，测量结果的相对标准偏差为2.2%～3.0%（n=7），加标回收率为86.0%～100.8%。该方法简便快速、准确、灵敏，检测成本低，可用于护肤膏酸砷形态的检测。

【关键词】高效液相色谱-原子荧光光谱法；护肤膏酸；砷形态

中图分类号： O657；TS254.7 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）32-0140-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.32.064

0 前言

砷是国际公认最具潜在危害性的重金属元素之一，是常见的、已知的、对人体健康伤害非常严重的一种污染物。砷毒性取决于其赋存形态，常见的砷化合物包括亚砷酸盐As（Ⅲ）、砷酸盐As（Ⅴ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜碱、砷胆碱、砷糖等。其中无机砷毒性大于有机砷毒性，As（Ⅲ）>As（Ⅴ）>MMA>DMA，砷胆碱和砷甜菜碱普遍被认为是无毒的[1，2]。

国际癌症研究机构（IARC）对职业接触者的研究表明，暴露于无机砷，对人具有致癌性，皮肤可吸收砷而引起皮炎、色素沉积等到皮肤病，最终引起肺、膀胱和皮肤癌[3]。我国《化妆品卫生规范》中规定砷的限量为10mg/kg。护肤膏酸中的砷主要来源于制造用水、无机矿物质、植物及海洋生物提取物和防腐剂等，As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA和DMA是其主要存在的毒性砷形态化合物[4]。因此化妆品中砷对人体的危害不能简单用总量来评估，其形态分析更科学准确。

目前，报道砷形态分析方法主要有高效液相色谱-原子荧光法（ HPLC-AFS）[4-6]、树脂分离-氢化物发生-原子荧光光谱法[8]、毛细管电泳法[9]、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱[9]、高效液相色谱-电感耦合等离子质谱法（HPLC-ICP-MS）[11]等。其中毛细管电泳法灵敏度偏低，需通过修饰或进样技术等方式提高灵敏度，对操作要求较高；ICP-MS仪器较昂贵，维护费用高，不适合一般实验室，且存在同量异位素、多原子分子离子以及多电荷离子的干扰问题。故选用了高效液相色谱-原子荧光联用法，利用高效液相色谱对护肤乳酸中不同形态的砷进行分离，用原子荧光仪进行定量，同时测定样品亚砷酸、砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸的方法，该方法具有检出限低、准确度和精密度高、检测成本低的优点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

PF52型原子荧光形态分析仪；BS224S型电子天平；TGL-16M台式高速冷冻离心机；Vortex-Genie2漩涡混合器；5860A超声波脱气仪；PHS-3C型酸度计；Milli-Q Advantage超纯水机型；BIO-DL Colour移液器（20-200ul）；

标准溶液：GBW 08666亚砷酸根As（Ⅲ）溶液标准物质，GBW 08667砷酸根As（Ⅴ）溶液标准物质，一甲基砷（MMA）溶液标准物质，二甲基砷（DMA）溶液标准物质，中国计量科学研究院；

试剂：磷酸二氢胺（分析纯）、硼氢化钾（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）、甲酸（分析纯）、硝酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、氨水（分析纯）、正己烷（分析纯）、冰乙酸（分析纯）。

1.2 样品提取

称量1.0 g左右样品，精确到0.001g，置于50mL具塞离心管中。加入15.0mL硝酸溶液（0.15mol/L），渦旋混匀，于60℃超声提取90min，冷却至室温，4℃冰箱中放置10min后，以8000r/min4℃离心15min，取上清液，过0.45μm滤膜备用。同时做空白试验。

1.3 标准溶液的配制

1000μg/L砷形态混合标准溶液配制：用移液枪分别吸取20μL As（Ⅲ）、86μL As（Ⅴ）、60μL MMA、28μL DMA标准物质溶液，用高纯水定容至1.5mL；

100μg/L砷形态混合标准中间液：吸取1.0mL1000μg/L混合标准溶液，用高纯水定容至10mL；

分别吸取上述砷形态混合标准中间液，用超纯水稀释定容，配成0，5.0，10.0，20.0，30.0，50.0μg/L的系列砷形态混合标准工作溶液，即配即用。

1.4 色谱条件

色谱柱：Hamilton PRP-X100阴离子交换柱；流动相：15mmol/L磷酸氢二胺溶液，用甲酸（10%）调节pH=6.0；等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：常温；阀控制：常规流路；进样体积：100μL。

1.5 荧光检测条件

负高压：300V；主灯电流：50mA；炉温：200℃；炉高：8mm；主气流量：300mL/min；辅助气流量：600mL/min；还原剂：20g/L硼氢化钾溶液-5g/L氢氧化钠溶液；载液：5%盐酸溶液。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

护肤膏酸中含有乳化剂，易在提取过程中使溶液形成乳浊液，选择用0.15mol/L硝酸溶液于60℃进行超声提取，考察了超声提取30，60，90，120min对砷提取效率的影响。结果表明，4种砷形态的提取率随提取时间的延长而增大，当提取时间为90min时，提取率达到最大；当提取时间大于90min时，提取率有下降的趋势，可能是由于提取时间过长而导致一部分砷损失。故试验选择提取时间为90min。

2.2 色谱流动相pH值的选择

流动相的pH值对分离效果有较大影响，试验考察了在15mmol/L磷酸氢二胺溶液中滴加甲酸或氨水调pH至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，对20μg/L的砷形态混合标准液进行测定。结果表明，当pH=6.0时，4种砷形态可以得到较好分离，故试验选择流动相pH为6.0。

2.3 载流盐酸浓度的选择

配制5种体积分数不同的盐酸溶液（1%，5%，10%，15%，20%），对20μg/L的砷形态混合标准液进行测定。结果表明，随着盐酸体积分数的增大，砷的荧光信号值逐渐增大；当盐酸的体积分数为5%时，砷形态的荧光信号响应值最大，效果最好，故选择载流盐酸的体积分数为5%。

2.4 还原剂硼氢化钾浓度的选择

硼氢化钾是氢化物发生反应的还原剂，其浓度直接影响砷氢化物的发生效率，试验考察了硼氢化钾溶液的质量浓度在5～50g/L之间时对测定砷各形态化合物色谱峰面积的影响。结果表明：当硼氢化钾溶液质量浓度在5～20g/L时，砷各形态化合物色谱峰面积随浓度升高而升高；但随硼氢化钾溶液质量浓度的升高，当浓度大于20g/L时，反应过于激烈并产生大量泡沫，影响气液分离，导致噪声增大，重现性差，而且高浓度的硼氢化钾不及时冲洗容易结晶使仪器管道堵塞。故试验选择硼氢化钾溶液质量浓度为20g/L。为防止硼氢化钾分解，加入5g/L氢氧化钠溶液。

2.5 色谱图

在1.5、1.6仪器工作条件下对100μg/L的砷形态混合标准工作溶液进行测试，色谱图见图1。由图1可见，在12min之内，亚砷酸盐、二甲基砷酸、一甲基砷酸、砷酸盐依次出峰，实现了完全分离，其保留时间分别为2.650，3.650，5.050，10.183min。

2.6 方法的线性及检出限

配制浓度为0，10，20，40，80，100μg/L的砷形态混合标准工作溶液，在1.5、1.6仪器工作条件下进行测定，每种浓度标准溶液进样为100μL，以各待测物的质量浓度（X）为横坐标，以色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。同时进行20次试剂空白试验，按照公式：C=3sb/b（C为方法的测定低限；s为空白值标准偏差；b为方法校准曲线的斜率）计算各待测物检出限。

4种砷形态化合物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表1。由表1可知，在0～100.0ng/mL范围内4种砷形态化合物质量浓度与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数r2均≥0.9990。亚砷酸根、二甲基砷检出限为0.029μg/L，一甲基砷、砷酸根检出限为0.025μg/L。

2.7 精密度试验

在不含待测物的空白护肤膏酸中，加入20μg/kg的砷形态混合标准工作溶液，按照1.3的分析方法進行前处理，在1.5、1.6的仪器工作条件下平行测定7次，结果见表2。由表2可知，亚砷酸根，二甲基砷，一甲基砷，砷酸根测定结果的相对标准偏差分别为2.4%，2.2%，3.0%，2.5%，表明该方法的精密度较高。

2.8 回收率试验

在不含待测物的空白护肤膏酸中，分别加上3个水平的砷形态混合标准溶液，按照1.3的分析方法进行前处理，在1.5、1.6的仪器工作条件下进行加标回收试验，测定结果见表3。由表3可知，样品的加标回收率为86.0%～100.8%，表明该方法的准确度较高。

3 结论

建立了利用HPLC-AFS同时测定护肤膏酸中亚砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）的方法，该方法具有检出限低，准确度和精密度高，检测成本低的优点，适用于护肤膏酸中亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷酸和二甲基砷酸4种砷形态的测定。

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