活血消异方对子宫内膜异位症大鼠盆腔粘连及转化生长因子-β1的影响*

李田田 孙伟伟 赵瑞华

(1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053)(2.北京市回民医院，北京 100054)

盆腔粘连是子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)的特征性表现，它与EMs相关疼痛[1]、不孕[2]及复发[3]等密切相关，且盆腔粘连使腹腔镜手术操作困难，增加手术风险。本课题组前期研究表明，活血消异方能显著改善EMs患者盆腔疼痛症状[4]；提高EMs小鼠IVF-ET成功率[5]；可通过下调“AAA通路”相关因子表达，抑制EMs的发生及发展[6]。本实验拟通过观察活血消异方对EMs大鼠盆腔粘连程度及TGF-β1的表达影响，进一步探讨其抑制EMs盆腔粘连可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用SPF级健康性成熟未孕雌性SD大鼠54只，体质量(220±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2006-0009。饲养于中国中医科学院广安门医院SPF级动物实验室:SYXK(京)2012-0001，灯光(12 L∶12D)。

1.2 实验药物

水合氯醛(批号：20140304，国药集团化学试剂有限公司，中国)：用100 mL无菌蒸馏水溶化10 g水合氯醛晶体，配制成10%水合氯醛溶液；苯甲酸雌二醇(批号：B131204，规格4 mg:2mL，宁波市三生药业有限公司，中国)：将2 mL苯甲酸雌二醇与植物油18 mL混合均匀，配成1∶10的苯甲酸雌二醇溶液；青霉素钠(国药准字：H13020657，规格：80万单位/支，华北制药股份有限公司，中国)。注射用醋酸亮丙瑞林：(进口注册号：H20110290，规格：3.75 mg，IPSEN PHARMA BIOTECH-Signes-法国)用无菌生理盐水溶解，配制成0.1 mg/mL溶液；活血消异方由丹参、莪术、赤芍、鸡内金、生薏仁等组成(由中医科学院广安门医院中药房提供)，以上生药加10倍量水，煎煮2次，合并煎液、过滤，药物浓缩使药物浓度为1.8 g生药/mL，药液4 ℃冰箱保存。

1.3 实验试剂及设备

TGF-β1大鼠酶联免疫吸附测定(Elisa)试剂,由达科为生物科技有限公司提供； BCA蛋白定量试剂盒(货号23225，规格：ReagentA：2×500 mL, ReagentB：1×25 mL,Albumin Standard：10×1 mL，美国Pierce公司)；倒置显微镜：IX-70，日本Olympus公司产品；离心机：CT15 RE型，日本HITACHI公司产品；酶标仪：Stat Fax-2100,Awareness公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1EMs盆腔粘连模型制备:模型组大鼠禁食12 h后，采用自体移植法在无菌条件下进行造模。大鼠称重，10%水合氯醛(0.38 mL/100 g)腹腔麻醉，置于超净台，腹部备皮，在尿道口上约1 cm处靠左侧做平行于正中线长约1.5 cm的纵切口进腹，进腹后在膀胱背侧找到子宫，游离左侧子宫，近端离左子宫角 1 cm 处结扎，远端离卵巢 2 cm 处结扎，并结扎两端间的子宫系膜血管，切除约 1.0 cm 长子宫段，立即放入盛有无菌生理盐水的培养皿中，用眼科剪沿系膜部剪开管状子宫，切割成3 mm×3 mm大小的子宫碎片，共4片，注意区分肌层与内膜面，内膜面朝向肠系膜，用5-0线缝合于右侧肠系膜血管丰富处，检查腹腔无出血后，腹腔留置青霉素钠0.25 mL，5-0线缝合腹壁，2-0线缝合皮肤进行逐层关腹。分笼喂养，待其自然苏醒。术后连续3 d肌注青霉素钠0.25 mL，每天1次，以预防术后感染，术后第二天开始肌注苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg·d-1，以促进异位灶的生长。

假手术组术前准备、麻醉、子宫的切除方法同模型组，紧贴肠系膜缝4针5-0尼龙线。

1.4.2分组及给药:将54只大鼠常规饲养7 d后，按照体质量随机分为空白对照组(6只)、假手术组(8只)、造模组(40只)，其中造模组及假手术组按照上述方法建立模型，其中造模组术后7 d内死亡5只，假手术组死亡2只。术后7 d随机抽取造模组大鼠5只、假手术组2只开腹观察，其中造模组5只大鼠均有不同程度的盆腔粘连，假手术组未见明显盆腔粘连。根据体质量，将剩余的造模组30只大鼠随机分为模型组(10只)、中药组(10只)、西药组(10只)，并开始连续给药，共28 d。中药组：根据表面积换算，每只大鼠灌胃活血消异方药液1.2 mL/日；模型组、假手术组及正常对照组，均予相同容积的生理盐水灌胃。西药组：醋酸亮丙瑞林0.04 mg·kg-1/日，肌肉注射，连续给药 7 d，后 21 d按起始剂量的1/5 维持。

1.4.3取材方法:连续给药28 d后，麻醉状态下开腹，对各组大鼠进行盆腔粘连评分后，模型组、中药组、西药组分别采取异位灶周围粘连腹膜组织，假手术组、正常对照组留取盆腔正常腹膜组织。将采取的组织分成两份，第一份经生理盐水冲洗、滤纸吸水、称重、机械匀浆、离心等预处理后置于-80 ℃冷冻，第二份迅速包埋于铝箔中置于-80 ℃冷冻。

1.4.4检测指标:

1.4.4.1 EMs盆腔粘连建模成功判定方法：造模术后第7 d开腹观察，若发现移植处有透明的小囊泡，囊内有液体积聚，并可见异位灶与周围有不同程度的粘连，则可证实造模成功。

1.4.4.2 粘连评分方法：连续给药28 d后，开腹充分暴露大鼠盆腔，首先由两位研究人员参照Haber等[7]标准独立进行粘连程度评分，取二者所评分数的平均分作为最终粘连评分：0分：无粘连-无粘连带；1～2分：轻微粘连-有少许粘连带，几乎难以辨认；3～4分：轻中度粘连-移植物周围可见一些粘连带，不需要分解；5分：中度粘连-移植物周围有一些粘连带，相对容易分解；6～7分：中重度粘连-粘连带较多，大部分围绕移植物，在肠管间也可见粘连带，难以分解；8～9分：重度粘连-肠管间有很多粘连带，粘连分解困难；10分：严重粘连-大量的粘连带使肠管、肠系膜、腹膜严重粘连，在不损伤脏器的情况下无法分解粘连。

1.4.4.3 TGF-β1含量Elisa检测：先按照美国Pierce公司BCA蛋白定量试剂盒使用说明书对所取组织匀浆上清液进行总蛋白浓度测定；然后严格按照Elisa试剂盒说明书流程进行检测，中止反应后在酶标仪上测定各孔A405值；最后根据TGF-β1含量(ng/mg)=测定上清液样品TGF-β1浓度(ng/mL)×稀释倍数/上清液样品总蛋白浓度(mg/mL)计算每毫克组织中TGF-β1蛋白含量。

1.4.4.4 TGF-β1 mRNA检测：引物采用使用primer3.0和NCBI-primer 合成，由北京信诺金达生物技术有限公司完成，PCR所用引物序列(TGF-β1基因：上游引物5′-CACTCCCGTGGCTTCTAGTG-3′；下游引物5′-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3′，扩增大小145 bp,GAPDHmRNA上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′；下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增大小150 bp。总RNA的提取方法按照试剂盒说明书进行，并测定总RNA浓度，吸光度A260 nm/A280 nm,比值在1.8～2.0。取2 μL总RNA逆转录，扩增条件：65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暂离心后加入反应液，37 ℃孵育40 min，95 ℃孵育5 min，-20 ℃保存备用，cDNA聚合酶连反应(PCR)扩增参数：95 ℃预变性10 min,95 ℃变性30 s，59 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s，45个循环,72 ℃终末延伸10 min。结果分析：取8 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，用BIOER PCR仪，采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 模型建立情况

肉眼观察结果：5只大鼠均有不同程度的盆腔粘连，粘连部位多见于病灶周围的肠管与肠管、肠管与肠系膜之间，病灶周围与腹壁之间的粘连少见；移植处可见大小不等囊泡，囊泡内充满淡黄色清亮透明液体，表面有丰富的血管网覆盖。假手术组肠系膜脂肪组织增厚，缝合线处未见明显粘连，见图1。

图1 造模术后7 d模型组和假手术组盆腔状况注：a.模型组；b.假手术组Fig.1 The pelvic adhesion of the model group and the sham operation group after operation 7 daysNote：a.the model group； b.the sham operation group

正常子宫内膜及异位灶HE染色：与正常子宫内膜相比较，异位灶呈囊状，囊内有黏液及炎性细胞，被覆上皮薄，腺体少，间质薄，见图2。

图2 正常子宫内膜与异位灶HE染色注：c.正常子宫内膜 ×100；d.正常子宫内膜 ×400； e.异位灶 ×100；f.异位灶 ×400Fig.2 Normal endometrial and ectopic lesions HE stainingNote: c.Normal endometrial ×100；d.Normal endometrial ×400； e.ectopic lesions ×100；f.ectopic lesions ×400

由此可见，随机抽取的5只已建模大鼠均已形成EMs盆腔粘连模型，造模成功率100%。进一步可假设造模组剩余30只大鼠已成为EMs盆腔粘连模型。

2.2 用药后各组大鼠盆腔粘连程度比较

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠均发生盆腔粘连，且粘连程度较重。西药组、中药组盆腔粘连评分均明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；西药组盆腔粘连评分平均值略低于中药组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表1。

图3 各组大鼠盆腔粘连情况注：h.假手术组；i.模型组；j.中药组；k.西药组Fig.3 The pelvic adhesions of each group rats after dministrationNote: h.the sham group；i.the model group； j.Huoxue xiaoyi Fang group；k.GnRh-α group

2.3 TGF-β1蛋白表达量比较

结果显示，模型组TGF-β1蛋白表达量显著高于假手术组及空白组，差异均有统计学意义(P<0.01)；假手术组与空白组TGF-β1蛋白表达量相当，差异无统计学意义(P>0.05)；中药组、西药组TGF-β1蛋白表达量均显著低于模型组，高于假手术组及空白组,差异均有统计学意义(P<0.05)；西药组TGF-β1蛋白表达量低于中药组，但差异无统计学意义(P>0.05)。(见表2)

表1 各组大鼠盆腔粘连程度比较Table 1 Comparison of pelvic adhesion degree

注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01；#与假手术、空白组比较，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

2.4 TGF-β1mRNA相对表达量比较

结果显示，模型组TGF-β1mRNA表达量较空白组及假手术组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；空白组与假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比较，中药组、西药组TGF-β1 mRNA表达量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组TGF-β1 mRNA表达量低于中药组，但差异无统计学意义(P>0.05)。(见表3)

表2 各组大鼠腹膜组织TGF-β1蛋白含量比较Table 2 Comparison of TGF-β1 protein relativeexpression in peritoneum among each

注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01；#与假手术、空白组比较，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

表3 各组大鼠腹膜组织TGF-β1mRNA相对表达量比较Table 3 Comparison of TGF-β1 mRNA relative expressionin peritoneum among each group

注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01；#与假手术、空白组比较，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

3 讨论

EMs盆腔粘连发病机制尚未明确，目前多认为与腹膜间皮细胞的损伤和缺失、组织缺氧和炎症相关[8]。有研究表明多种细胞因子网络参与机械性损伤腹腔粘连的形成过程，其中实验研究多集中在调控细胞外基质的合成、纤维蛋白的沉积和降解之间的平衡等方面。EMs是一种免疫性炎性疾病[9]，研究表明TGF-β与脏器纤维化相关[10]，TGF-β1 可以通过下调 T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞的活性而抑制免疫反应[11]，有利于内膜细胞在腹膜腔内逃脱机体的免疫监视而存活，此后在异位灶的刺激下，腹腔产生大量的炎性因子介导一系列炎性反应，导致盆腔粘连的形成。有研究发现EMs患者腹腔液中 TGF-β1 在有粘连组明显高于无粘连组，且与粘连程度呈正相关关系[12]，这说明TGF-β1很可能参与了EMs盆腔粘连的发生、发展。

中医学认为EMs归属于祖国医学“癥瘕”、“痛经”、“不孕”等范畴，其病理实质是“血瘀”，瘀血既是其致病因素，又是其病理产物，瘀血阻滞，日久不化而成癥瘕。李光荣教授以“离经之血”立论，组成系列方药，赵瑞华教授在师承李教授学术思想的基础上，提出从“郁”论治，提炼核心药物组成活血消异方。许多研究表明活血化瘀中药有调节免疫及内分泌、改善局部血液循环、抑制血管生成的作用，可促进异位内膜细胞凋亡、粘连软化、包块吸收、恢复卵巢功能[13-14]。活血消异方以丹参、赤芍、莪术等活血消癥中药为主，配伍柴胡、香附疏肝理气，共奏活血化瘀、缓消癥块之效。

本研究通过建立EMs盆腔粘连大鼠模型，围绕TGF-β1这一粘连形成机制的靶点，以活血消异方及达菲林作为干涉手段，从盆腔粘连情况、TGF-β1蛋白和基因水平进行比较，研究内异症盆腔粘连的发生发展与TGF-β1的关系。结果表明，假手术组在盆腔粘连发生率、盆腔粘连程度上远远低于模型组；与模型组相比，活血消异方与达菲林组在给药4周后均能改善盆腔粘连程度，显著下调粘连组织中TGF-β1基因及蛋白表达水平，且组间无显著性差异。说明EMs盆腔粘连与单纯机械性损伤造成的粘连不同，活血消异方和达菲林均能阻断TGF-β1的表达以抑制盆腔粘连的形成，且两者在抑制EMs盆腔粘连方面的疗效相当。