西宁市牦牛肠道病毒的流行病学调查与分析

杨永宁

（青海畜牧兽医职业技术学院 西宁 812100）

牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）属于小RNA病毒科肠道病毒属，李英利等于2011年首次从内蒙古腹泻犊牛中分离鉴定出了国内第一株BEV，随后我国研究学者从山东、山西、北京、吉林等地陆续分离鉴定出不同基因型的BEV，BEV在我国牛群中的流行正在逐步增加。一般认为BEV单独感染的致病性不强，只引起轻度腹泻或隐性感染，但BEV常常与其他病原体发生混合感染和继发感染，进而暴发以繁殖障碍、腹泻为主要特征的传染病，导致死亡率升高，降低养殖经济效益，危害养牛产业健康发展。牦牛是我国高原牧区特有的一个独立物种，是当前青海省农村饲养的主要家畜，也是青海牧区群众重要的生活与生产资料。近年来随着青海省牦牛养殖产业的快速发展，牦牛腹泻的发生率逐渐升高，为全面掌握青海省西宁市牦牛群中BEV的感染现状，本研究利用一步法RT-PCR方法首次对2017—2018年采集于西宁市的259份牦牛粪便样品进行了BEV的病原学检测与分析，为西宁市牦牛BEV综合防控措施的制定提供了数据支持和参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2017-2018年共采自青海省西宁市城东区、城西区、城北区、大通县、湟中县、湟源县共计6个区（县）的牦牛粪便样品259份，其中临床中已表现出腹泻症状的牦牛粪便样品74份，临床中无腹泻症状的健康牦牛粪便样品185份。

1.2 试剂盒

病毒基因组RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；一步法RT-PCR扩增试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 引物的设计

参照陈新诺等的方法设计合成一对BEV特异性检测引物（P1：5’-GGCGC TAGTACTCTGG TACG-3’；P2：5’-CGCGTTA C GACGTA GCAA-3’），预扩增片段大小为556bp。

1.4 核酸提取

利用病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取采集的259份牦牛粪便样品的核酸RNA。

1.5 一步法RT-PCR扩增

以提取的RNA为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒并参照陈新诺等的PCR扩增方法进行一步法RT-PCR扩增。一步法RTPCR扩增程序为：50℃反转录40min；94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火 30s，68℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min；4℃终止反应。

1.6 电泳检测

一步法RT-PCR扩增结束后，取扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外成像仪下观察检测结果，对检测结果进行BEV感染情况的统计分析，分别掌握青海省西宁市不同地区腹泻牦牛群和健康牦牛群中BEV的感染现状。

2 结果与分析

2.1 腹泻牦牛样品的检测结果

如表1所示，采用一步法RT-PCR方法对2017—2018年采自青海省西宁市不同地区的共计74份腹泻牦牛粪便样品进行BEV的病原学检测，共检测出阳性样品24份，平均阳性感染率为32.43%，其中湟中县的阳性感染率最高，达47.06%；湟源县次之，为42.86%；城西区的阳性感染率最低，仅为12.50%。该结果表明西宁市不同地区的腹泻牦牛群中均存在BEV的感染，且不同地区感染率差异较大，部分地区阳性感染率较高。

2.2 健康牦牛样品的检测结果

如表2所示，采用一步法RTPCR方法对2017—2018年采自青海省西宁市不同地区的共计185份健康牦牛粪便样品进行BEV的病原学检测，共检测出阳性样品33份，平均阳性感染率为17.84%，其中湟中县的阳性感染率最高，达26.19%；湟源县次之，为24.32%；城北区的阳性感染率最低，仅为5.56%。该结果表明西宁市不同地区的健康牦牛群中均存在BEV的感染，且不同地区感染率差异较大，部分地区阳性感染率较高。

表2 健康牦牛样品的RT-PCR检测结果

3 讨论

近来来，随着我国牦牛养殖产业的快速发展，牦牛BEV的流行率也随之逐步增加，陈新诺等应用RT-PCR方法对青藏高原地区222份腹泻牦牛粪便样品进行了BEV的流行病学调查，BEV平均阳性感染率为29.40%；何欢等应用RTPCR方法对青藏高原地区235份腹泻牦牛粪便样品和116份健康牦牛粪便样品进行了BEV的流行病学调查，腹泻牦牛阳性感染率为31.06%，健康牦牛阳性感染率为24.14%。本研究采用RT-PCR方法首次对2017—2018年采自青海省西宁市城东区、城西区、城北区、大通县、湟中县、湟源县的74份腹泻牦牛粪便样品和185份健康牦牛粪便样品进行了BEV的核酸检测与分析，结果显示西宁市不同县区腹泻牦牛和健康牦牛中均存在BEV的感染，其中不同县区腹泻牦牛阳性感染率在12.50%~47.06%之间，平均阳性感染率为32.43%，不同县区健康牦牛阳性感染率在5.56%~26.19%之间，平均阳性感染率为17.84%。本次调查结果与陈新诺等、何欢等对牦牛感染BEV的流行病学调查结果基本一致，表明我国牦牛群中已存在BEV的感染与流行，部分地区阳性感染率较高，且健康牦牛群中也能检测到BEV的存在，可见BEV能够在牦牛群及其生活环境中肆意传播，BEV一旦和其他致病原混合感染将导致牦牛患有多种临床疾病甚至死亡，其造成的危害不容小视，加强牦牛BEV的综合防控已迫在眉睫。■