一氧化氮在反流性食管炎发病机制中的研究进展

肖　姣，朱凌云

(上海中医药大学附属上海市中医医院，上海 200071)

反流性食管炎(RE)是胃、十二指肠等内容物如胃酸、胃蛋白酶和十二指肠液反流至食管而引起食管黏膜损伤的一种炎性病变，是胃食管反流病(GERD)的一种。北京与上海两地在90年代的流行病学调查结果显示：RE为1.92%[1]。而2007年北京的一项研究显示，RE的发病率为4%，表明我国的RE发病率呈上升的趋势[2]。其发病原因有多种，具体机制还不确切，主要有食管黏膜清除能力下降、食管下括约肌(LES )压力降低、食管黏膜屏障功能损伤、食管内脏高敏性[3]。一氧化氮(NO)作为一种气体信使分子，在生物体内有广泛的生理和病理意义。近年来关于NO与RE的发病机制及信号转导的关系已经取得了一些新的研究进展，文章主要综述近几年NO与RE发病机制的相关研究进展。

1　中医病机

祖国医学认为RE属于“吐酸”“嘈杂”“呕苦”“胸痛”“胃痞”等范畴，而关于其病机不同学者有不同观点。杨芸峰等[4]认为RE病机主要为脾失健运，肺胃不降致胃气上逆，其病位在食管，与肺脾两脏密切相关。而屈杰等[5]认为RE病机是肝郁脾虚，胃失和降，病位在食管，与胃、脾、肝关系密切。贾博等[6]则从李东垣“阴火”理论治RE，认为胃阴伏火、痰气交阻、清气不升、浊气不降为其关键病机。但总体来说其基本病机为气机升降失调，目前有中医学者认为中医的升降理论与现代医学的胃肠动力类似，而中医中药复方与NO在RE病机中的相关研究也多有报道。马淑颖等[7]通过实验发现疏肝和胃方能降低RE大鼠食管组织中的NO和血管活性肠肽(VIP)的含量来调节一过性下食管括约肌松弛(TLESR)的机制，达到治疗RE的目的。赵艳等[8]发现化浊解毒方能够降低大鼠食管黏膜组织VIP和NO的表达水平，升高黏膜P物质(SP)的表达，改善食管组织的病理损伤，表明化浊解毒方治疗机制可能是调节与食管黏膜组织损伤相关的因子。代二庆等[9]用旋覆代赭汤治疗酸性RE模型大鼠发现能降低食管黏膜NO浓度，减轻炎症反应及减少TLESR的发作时间和次数，改善LES松弛。冯云霞等[10]研究调中颗粒对混合RE大鼠食管黏膜脑肠肽和一氧化氮合酶(NOS)的影响，发现调中颗粒可能通过提高SP表达、减少NOS和VIP的表达调节胃肠运动，从而抑制反流及促进黏膜损伤修复。这些研究虽然将中草药复方与现代医学观点相结合，但是并没有深入探讨方药降低NO的具体机制。

2　NO与RE的具体机制

2.1NO对食管黏膜血管的扩张作用酸、胃蛋白酶等反流发作时，食管黏膜血流量增加能加强黏膜抵御损伤的能力。而NO通过调节黏膜血管张力可以增加黏膜的血流，能够供给黏膜以充足的氧气和营养物质，增强食管上皮的保护作用[11]。有研究发现乙酰胆碱、缓释肽等扩血管物质可以引起内皮细胞释放NO，说明NO除了扩张血管，还可能是其他血管物质的协同剂或者终末介质[12]。另有研究表明，食管黏膜对酸、胃蛋白酶和胰酶等的刺激能迅速进行适应性保护，且不通过依靠细胞增殖而实现，这可能与NO介导的局部作用——增加血流有关[13]。

Soteras等[14]通过实验发现，逐渐加大NOS抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(L-NNA) 的使用剂量，食管炎症程度随之逐渐加重，说明NO可能参与细胞保护作用。Pawlik等[15]用NO释放的阿司匹林(ASA)衍生物或用NO供体(三硝酸甘油酯)的天然ASA衍生物预处理动物发现，这些衍生物对RE食管黏膜有益，其可能的机制是NO增加了食管黏膜血流量。另外，NO 也可以通过减少炎性因子的相互作用、增加黏液分泌或抑制胃酸等机制起到黏膜保护作用[13]。

2.2NO对食管组织的促炎效应研究表明，NO也是重要的炎性递质[15]。一般认为诱导型NOS(iNOS)产生的NO主要发挥促炎效应，其在正常状态下不表达，需细胞因子等刺激后才会诱导性表达，产生的NO达到一定的浓度(>2 nmol/h)，与超氧化物反应产生毒性很强的过氧化亚硝酸(PXN)，PXN加速琉基化合物及脂类的氧化反应，引起毒性作用，造成细胞及组织的损害，发挥其炎症递质作用[16]。NO 本身也是氧自由基，在缺血、缺氧状态下，巨噬细胞和白细胞内iNOS被激活，产生的大量NO可引起细胞损伤和黏膜炎症反应[17]。说明NO在组织或细胞内可发挥保护和毒性双重效应。

Ishiyama等[18]通过给酸性RE模型大鼠口服亚硝酸钠加抗坏血酸和用iNOS抑制剂PBIT治疗，发现在回流酸的刺激下，通过亚硝酸钠加抗坏血酸的化学反应在食管细胞腔内产生的NO大大加剧了食管损伤；在亚硝酸钠加抗坏血酸应用7 d后用PBIT治疗显著减轻了由外源性NO暴露产生的食管损伤，而在应用后3 d对食管损伤没有产生明显影响，表明模型中外源性和内源性NO对发病机制的影响可能根据食管损伤发展的时间过程而不同。虽然早期外源性细胞腔NO对于扰乱食管上皮功能是重要的，且与回流的胃蛋白酶和胃酸协同作用，但是一旦保持产生iNOS的大量炎症细胞在炎症组织中积累，内源性NO可能在进一步加重黏膜损伤中变得更重要。近期发表在JAMA上的一项研究称造成GERD的原因可能是免疫反应的损伤而不是胃酸等反流导致的化学性损伤[19]，虽然笔者称目前该研究不能代表所有的GERD患者，但是这一结果引起了很多学者的关注转移。

2.3NO对食管LES的舒张作用现在已经证实，食管环肌内含有大量NO，NO作为一种支配LES的非肾上腺能和非胆碱能(NANC)神经递质，可以引起LES松弛，诱发RE产生。NO 主要通过旁分泌作用调控食管、胃肠道平滑肌的舒张运动[13]。目前已经公认的机制是：一方面NO可能是触发TLESR的始动因子[20]，通过激活鸟苷环化酶(GC)，使环磷鸟苷(cGMP)增加，降低细胞内Ca2+浓度或对Ca2+的敏感性，使胞浆游离Ca2+浓度降低，抑制肌球蛋白和肌动蛋白结合，导致平滑肌松弛，引起LES舒张；另一方面通过激活依赖cGMP的蛋白激酶，使蛋白磷酸化引起LES松弛[13]，在前者神经型NOS(nNOS)发挥主要作用[21]。

以往研究表明，在体外采用负鼠的LES肌条发现低浓度的NO可以引起LES舒张[22]；而在人胃食管连接处细胞腔内产生的高浓度NO可以穿透上皮细胞影响LES的平滑肌细胞，引起肌肉松弛导致胃内容物等反流到食管[23]，而最近的研究表明细胞腔内产生的NO在生理条件下对LES的功能没有影响[24]，Terai等[25]在2009年也已经证明饮食摄入的硝酸盐在生理条件下不影响胃动力比如胃排空。说明外源性NO可能对LES功能无影响。王薇等[26]证实食管下端括约肌压力(LESP)与内源性NO呈负相关，可使LES基础压力降低及LES松弛，导致胃等内容物反流到食管；郭晓燕等[27]通过实验发现nNOS和iNOS主要在食管黏膜上皮细胞胞质中表达，且在RE患者食管中表达明显高于非糜烂性反流病(NERD)组和健康对照组，而其mRNA表达量也是大于正常组和NERD组，提示nNOS和iNOS可能共同引发食管平滑肌的收缩和舒张障碍，且随着病情加剧呈进行性加重的趋势。但这两项研究都未深入阐明具体机制。

3　NO介导LES松弛有关的信号通路

发挥第二信使的NO可通过与可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的作用，催化三磷酸鸟苷(GTP)生成环鸟苷酸(cGMP)，再激活依赖的蛋白激酶G(PKG)，对下游靶蛋白或靶细胞等发挥生物学效应，即NO-cGMP-PKG途径[28-30]。LES是位于胃食管连接处特殊增厚的环行肌，且全由平滑肌组成。在平滑肌的收缩过程中，肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平是平滑肌收缩程度的一个重要决定因素，且受到依赖Ca2+/钙调蛋白(CaM)的肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和Ca2+非依赖的肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的双重调节[29，31]。食管的蠕动通常是依赖LES的收缩来实现，而NO介导的cGMP-PKG途径与上述双重调节方式都有相互联系，共同调节LES的舒张与收缩反应。

3.1钙依赖性机制调节平滑肌收缩的经典机制为粗肌丝相关调节机制，又称为Ca2+-CaM-MLCK依赖的机制[32]。平滑肌细胞受刺激后，胞外Ca2+内流和肌质网(SR)Ca2+外流，前者通过刺激膜上钙通道开放，促进Ca2+内流，后者主要通过三磷酸肌醇(IP3)与其受体(IP3R)结合后，引起钙通道开放，细胞Ca2+i浓度升高达阈值后，Ca2+与CaM 结合，继而又与MLCK结合为三元体使其活化MLCK，MLCK催化20 kD MLC上Ser19位点磷酸化，激活肌球蛋白分子上的ATP酶，肌球蛋白磷酸化后与肌动蛋白结合，发生相互作用，引起收缩[32-33]；当Ca2+浓度下降到一定浓度时，CaM便与MLCK分离，活性消失，不再激活肌球蛋白，而不能与肌动蛋白结合，导致肌肉松弛[34]。食管中产生的NO还可通过cGMP-PKG途径抑制IP3生成，减少SR钙库释放Ca2+，使Ca2+浓度迅速下降，LES舒张，导致反流物增多，RE加重[27]。

3.2非钙依赖性机制非钙依赖性机制调节即钙敏化机制，其主要机制是增加了调节装置对Ca2+的敏感性，即通过抑制MLCP，引起MLC磷酸化水平增高，使平滑肌收缩增强[35]。而NO也可通过cGMP-PKG途径直接激活MLCP使原已磷酸化的MLC脱磷酸而与肌动蛋白分离，抑制肌球蛋白与肌动蛋白相互作用而导致LES松弛[36]。近年来，很多研究[24，37-38]表明RhoA/ROCK通路在钙敏化机制中发挥重要作用。RhoA蛋白属于小GTP结合蛋白中的Rho家族，它与GTP结合后呈现活性状态，ROCKs是RhoA蛋白下游的信号分子，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，研究发现RhoA的作用主要是通过ROCK实现的[35]。ROCK 介导的信号通路可直接影响平滑肌细胞的收缩功能，激活的RhoA·GTP 在下游激活其靶目标ROCK，后者与MLCP 的MYPT1 亚基结合，使其T850 和T696 位点发生磷酸化而失活，导致MLC的磷酸化水平增高，进而增强平滑肌的收缩[33]。而cGMP-PKG途径的PKG可直接抑制RhoA呈无活性的RhoA·GDP状态，不能激活ROCK，而导致MLC脱磷酸，平滑肌舒张[36]。RhoA/ROCK 通路介导的平滑肌收缩目前在心血管疾病及糖尿病等中研究较多，而在GERD中的研究少见报道，这为我们研究NO介导的信号途径在RE中的下游机制及靶点提供新思路。

3.3与其他通路的相关性柳刚[39]发现抑制p38 MAPK通路可以减少酸和胰蛋白刺激诱导的食管黏膜上皮细胞iNOS的表达上调和NO生成；Liying等[40]发现在RE向Barret食管进展的过程中NO通过调节NF-кB水平产生一个自动调整作用，在低浓度NO时，NF-кB水平上升，上调iNOS表达，相反，在高浓度NO时，NF-кB水平和DNA结合活性被抑制，减少iNOS转录，显示了NO浓度依赖的双重性。目前MAPK途径与NF-κB途径对反流性食管炎食管组织中NO表达的影响方面的研究较少，其相关机制不是很明确，还需要进一步的研究，是否还有其他途径参与也尚不清楚。

4　存在问题及展望

长期以来，对于RE 的治疗侧重于抗酸治疗，大多以质子泵抑制剂为主，但其停药后复发率高，且价格较昂贵，相对而言，中医药治疗有不良反应少、复发率低及价格低廉等特点。对NO与RE的相关机制及NO、NOS抑制剂的深入研究，将有助于RE的诊治，但开发适合临床的相关药物并不多见，而已经开发出的一些包括NOS抑制剂在内的控制TLESR的药物和NO供体剂由于存在毒副作用和口服效果差等方面的问题，加之NO发挥的双重作用，目前未能广泛使用。如何提高靶向性、专一性及降低毒副作用还有待于进一步研究，这对我们祖国医学是一个机遇也是一个挑战，其研究空间及应用前景较大。而目前中医药关于NO与RE的相关性有所研究，但具体机制并未阐明，是否有其他途径参与尚不清楚。

[参考文献]

[1]潘国宗,许国铭,郭慧平. 北京上海胃食管反流症状的流行病学调查[J]. 中华消化杂志,1999,19(4):223

[2]侯鹏,吴志强,殷健,等. 反流性食管炎的临床流行病学调查[J]. 感染、炎症、修复,2007,8(1):33-35

[3]王瑞，唐艳萍. 胃食管反流病病因病机研究进展[J]. 中国中西医结合外科杂志，2015，21(2)：201-203

[4]杨芸峰,朱凌云. 朱凌云治疗胃食管反流病的临床经验总结[J]. 四川中医,2013，31(1):14-15

[5]屈杰,杨靖,孔文霞,等. 李培主任医师辨治胃食管反流病思路与经验总结[J]. 亚太传统医药,2015,11(14):45-46

[6]贾博,白光. 从李东垣“阴火”理论论治胃食管反流病[J]. 广西中医药,2016,39(4):45-46

[7]马淑颖,朱生梁,程艳梅,等. 疏肝和胃方对混合反流性食管炎大鼠一氧化氮合酶和血管活性肠肽的影响[J]. 山西中医,2006,22(1):48-50

[8]赵艳,霍永利,李博林. 化浊解毒方对反流性食管炎大鼠一氧化氮、血管活性肠肽及P物质的影响[J]. 中医杂志,2015,56(7):607-610

[9]代二庆,李海英,刘子泉,等. 旋覆代赭汤对反流性食管炎模型大鼠食管黏膜一氧化氮的影响[J]. 现代中西医结合杂志,2004,13(11):1425-1428

[10] 冯云霞,时昭红,张介眉,等. 调中颗粒对反流性食管炎大鼠食管黏膜脑肠肽和一氧化氮合酶的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2010,16(15):154-157

[11] 张忠兵. 一氧化氮在消化系统的生成和分布及其临床意义[J]. 中华消化杂志,1994,14(4):236-239

[12] 王吉村,孙长凯. 消化系统中的一氧化氮机制[J]. 国外医学：内科学分册,1996,23(8):326-329

[13] 王虹,刘宾. 一氧化氮与胃食管疾病关系的研究进展[J]. 中华内科杂志,2003,42(12):882-883

[14] Soteras F,Lanas A,Fit eni I,et al. Nitric oxide and superoxide anion in low-grade esophagitis induced by acid and pepsin in rabbits[J]. Dig Dis Sci,2000,45(9):1802-1809

[15] Pawlik M,Pajdo R,Kwiecien S,et al. Nitric oxide (NO)-releasing aspirin exhibits a potent esophagoprotection in experimental model of acute reflux esophagitis. Role of nitric oxide and proinflammatory cytokines[J]. Journal of Physiology & Pharmacology,2011,62(1):75-86

[16] Zayachkivska O,Pshyk-Titko I,Hrycevych N,et al. New insight into oesophageal injuryand protection in physiologically relevant animal models[J]. Electrophoresis,2014,65(2):295-307

[17] Iijima K,Shimosegawa T. Involvement of luminal nitric oxide in the pathogenesis of the gastroesophageal reflux disease spectrum[J]. Journal of Gastroenterology & Hepatology,2014,29(5):898-905

[18] Ishiyama F,Iijima K,Asanuma K,et al. Exogenous luminal nitric oxide exacerbates esophagus tissue damage in a reflux esophagitis model of rats[J]. Scandinavian Journal of Gastroenterology,2009,44(5):527-537

[19] Dunbar KB,Agoston AT,Odze RD,et al. Association of acute gastroesophageal reflux disease with esophageal histologic changes[J]. Jama,2016,315(19):2104-2112

[20] 胡运彪,许树长,戴军,等. 一氧化氮在实验性反流性食管炎发病机制中的作用[J]. 中华消化内镜杂志,1999,16(6):331-333

[21] De GR,Parodi JE,Brecha NC,et al. Nitric oxide producing neurons in the monkey and human digestive system[J]. Journal of Comparative Neurology,1994,342(4):619-627

[23] Iijima K,Henry E,Moriya A,et al. Dietary nitrate generates potentially mutagenic concentrations of nitric oxide at the gastroesophageal junction[J]. Gastroenterology,2002,122(5):1248-1257

[24] Seenan JP,Wirz AA,Robertson EV,et al. Effect of nitrite delivered in saliva on postprandial gastro-esophageal function[J]. Scandinavian Journal of Gastroenterology,2012,47(4):387-396

[25] Terai S,Iijima K,Asanuma K,et al. Lack of modulation of gastric emptying by dietary nitrate in healthy volunteers[J]. Tohoku Journal of Experimental Medicine,2009,218(1):73-79

[26] 王薇,付亮,高欣,等. 胆汁反流与食管下端括约肌组织中一氧化氮及血管活性肠肽的关系[J]. 中国综合临床,2005,21(2):134-136

[27] 郭晓燕,王婷,董蕾,等. 一氧化氮合酶在胃食管反流病患者食道黏膜的表达[J]. 西安交通大学学报：医学版,2015,36(3):373-377

[28] Hofmann F,Ammendola A,Schlossmann J. Rising behind NO: cGMP-dependent protein kinases[J]. Journal of Cell Science,2000,113(Pt 10):1671-1676

[29] 李志利,姜世忠. RhoA-ROK通路在平滑肌收缩中的作用[J]. 生理科学进展,2005,36(4):341-344

[30] 张冰轮,刘春峰. NO-cGMP-PKG通路在心血管疾病中研究进展[J]. 国际儿科学杂志,2015，42(4):420-423

[31] Somlyo AP,Somlyo AV. Ca2+Sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II:modulated by G proteins, kinases,and myosin phosphatase[J]. Physiological Reviews,2003,83(4):1325-1358

[32] Berridge MJ. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms[J]. Journal of Physiology,2008,586(Pt 21):5047-5061

[33] Kureishi Y,Kobayashi S,Amano M,et al. Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation[J]. Journal of Biological Chemistry,1997,272(19):12257-12260

[34] Murphy RA,Walker JS. Inhibitory mechanisms for cross-bridge cycling:the nitric oxide-cGMP signal transduction pathway in smooth muscle relaxation[J]. Acta Physiologica Scandinavic,1998,164(4):373-380

[35] 张婷,周江睿,王云霞,等. RhoA/ROCK信号通路对血管平滑肌收缩的调节作用及研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2010,10(12):2367-2370

[36] Sims SM,Chrones T,Preiksaitis HG. Calcium sensitization in human esophageal muscle:role for RhoA kinase in maintenance of lower esophageal sphincter tone[J]. Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics,2008,327(1):178-186

[37] Rattan S,Singh J,Kumar S,et al. Nature of extracellular signal that triggers RhoA/ROCK activation for the basal internal anal sphincter tone in humans[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology,2015,308(11):G924-G933

[38] Al-Shboul O. The role of the RhoA/ROCK pathway in gender-dependent differences in gastric smooth muscle contraction[J]. The Journal of Physiological Sciences,2016,66(1):85-92

[39] 柳刚. p38MAPK在GERD发生发展过程中的作用和机制研究[D]. 上海：第二军医大学,2015

[40] Liying Yang,Fritz Francois,Zhiheng Pei. Molecular pathways:pathogenesis and clinical implications of microbiome alteration in esophagitis and Barrett’s esophagus[J]. Clinical Cancer Research,2012,18(8)：2138-2144