食源性微生物的检测方法

◎ 张雪颖

（苏州大学 剑桥-苏大基因组资源中心，江苏 苏州 215123）

食品安全是公众最为关注的焦点之一。食源性病原菌，如单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌属和空肠弯曲杆菌等广泛存在并与疾病爆发密切相关。尽管食品加工技术的改进和严格的工业卫生环境限制了微生物的致病性，但食源性疾病的爆发仍在继续。由微生物和生物化学活性引起的食物腐败对食品工业造成极大的经济损失，因此，有效地检测原料、食品加工环境和最终产品中引起疾病和腐败的微生物对于预防食源性疾病的大规模流行和资源的损失至关重要。

1 常规检测方法

食品行业采用常规微生物检测方法，观察人工培养基中细菌的生长。通常需要预富集步骤以成功地从复杂食物系统中分离目标微生物。预富集之后，将样品铺板在固体培养基上，再选择的温度和气氛下孵育。最后，根据各种生化和/或免疫学特征鉴定分离物。许多生长培养基可用于选择性检测食源性病原体和腐败生物。整个过程需要5～7天。

常规方法费时费力，这为许多工业应用带来了不便，特别是在今天的全球分销市场上。食品中的微生物可进入休眠状态或损伤状态，并在检测培养基上变得不可培养；这将导致低估污染水平，或未能将病原体与污染样品隔离。开发恢复方法以复苏损伤的食源性微生物，对于准确的数据分析具有重要意义。一些恢复步骤利用修复试剂来恢复细胞损伤，然而除了额外的时间消耗，受伤的细胞可能无法充分恢复，从而需要新的方法来检测非受伤和受伤的生物体以防止假阴性结果。

2 生化鉴定方法

快速准确地鉴定从食物样品中分离的病原体对于质量保证和食品安全问题源头的快速识别具有重要意义。微生物的生化自动识别系统被广泛应用于食品微生物实验室。自动化系统减少了鉴定分析的时间，增加了被分析样品的数量，提高了各种分析的准确性。因此，自动化已经用于许多流行病的诊断，其现正与微型生化试剂盒一起使用。此类试剂盒用于鉴定常见的食源性病原体，如肠道细菌、弯曲菌、李斯特菌、沙门氏菌等。微型装置由一次性装置组成，该装置含有15～30个培养基或特异性滴定的底物以鉴定特定的细菌群或物种。仪器的进步使得套件的自动化系统成为可能，这些自动化仪器孵育细菌，监测生化变化，为任何富集群体生成表型谱，并通过比较配置文件与已知的配置文件来识别细菌。另一种分析细菌组成或代谢特性的自动细菌鉴定系统，如脂肪酸谱或碳氧化谱，被用于病原体检测。与传统方法相比，这些系统具有一些重要优势，包括减少人工，减少人为错误，增加样品通量及更快的周转时间。

3 免疫鉴定法

抗原和抗体之间的高度特异性结合，特别是单克隆抗体，促进了各种免疫学检测的发展。免疫分析方法简单，用途广泛，是一组快速病原体检测方法，可用于食品和环境的检测。免疫学分析包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、颗粒凝集法（LA）、免疫沉淀法、免疫荧光显微镜和免疫传感器法。

3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是目前应用于食品病原体检测的最成熟的免疫学技术。ELISA被描述为“三明治”试验，与传统的培养方法相比，大多数ELISA检测所需时间病毒为1 h，细胞小于36 h。没有预富集时ELISA的灵敏度范围只有103～105个细菌细胞，不足以检测导致低水平污染的致病性细菌细胞。

3.2 颗粒凝集法（LA）

LA是最简单的免疫分析方法，微孔中的抗体包被颗粒与来自血清或来自食物的纯培养分离物样品的稀释液共同孵育。如果样品中含有要筛选的标记，就会检测到颗粒的凝集。一种名为反向被动乳胶凝集（RPLA）的LA修饰物可以检测可溶性抗原。RPLA主要用于检测食品提取物中的毒素或纯培养物中的毒素。

3.3 免疫沉淀法

免疫共沉淀是基于“三明治”程序。样品被直接装入含有附加胶体金标记抗体的室内，当样品扩散到固体基质后，任何抗体识别都会导致可检测的颜色变化。该方法快速、简便。结果可以在10 min内读取，无需任何其他操作。然而，该程序需要一个漫长的预富集步骤。

3.4 免疫传感器

免疫传感器通过将反应固定在被称为换能器的固体表面上来检测抗原-抗体结合。经过特定的绑定后，传感器将表面变化参数转换为可检测的电信号。许多研究已经探讨了应用新型免疫传感器技术检测和计数食源性病原体的潜力。这种方法在几个小时内就会产生结果，类似于经典ELISA。免疫传感器是便携式的，产生可读的数字信号而无需人工操作。然而大多数免疫传感器需要昂贵的设备和较长的前期准备。

3.5 免疫磁分离（IMS）

免疫磁分离（IMS）是一种能增强免疫分析和改善上述问题的替代方法。IMS对磁性珠的特异性抗体进行配对，并有效地从食物基质中捕获目标细菌细胞。大多数情况下，IMS与其他检测方法相结合，如ELISA、磁力显微镜、PCR或平板计数等，以提高检测灵敏度。例如在ELISA分析中，IMS的预选择步骤可以使检测灵敏度提高近100倍。

4 生物传感器

在微生物检测领域，生物传感器是能够将生物反应转化为可观测信号的分析工具。生物传感器一般由生物识别元件和换能器两部分组成。生物识别元件体由固定的生物化合物组成，可识别目标分析物。传感器将识别样品转换为可测量的电信号、光信号或热信号。有时，一个额外的放大器响应来自传感器的小信号，并为信号处理器提供更大的输出信号。用于病原体检测的生物传感器根据其使用的生物受体可分为三类，分别是细胞代谢模式、抗体或抗原标志及核酸分析。

抗体传感器是微生物诊断中最流行的生物传感器，其原理依赖于上述抗原和抗体之间高度特异性的三维图像匹配。两种类型的基于免疫学的生物传感器，第一种采用固定在电极上的捕获抗体，来捕获目标抗原。通过氧化还原分子或酶标记的二抗体来实现信号转导。第二种利用固定在电极上的抗原来检测特定的抗体。

酶标记免疫分析方法因其高灵敏度和直接可视化等优点而日益受到人们的重视。事实上，便携式生物传感器基于ELISA原理，但更小，更快，更易解释和更方便。

生物分析传感器的最新进展利用了某些酶发射光子、生物发光，并伴随生化反应。三磷酸腺苷（ATP）-生物发光广泛应用于食品工业，以快速计算加工环境中总细菌的存在并检测饮用水或饮料中的病原体。该技术基于ATP的存在来测量光强度，一种通过水解ATP来产生光的荧光素酶。光的强度一般与污染程度平行。不仅仅是活细菌，ATP是任何生物物质的基本化合物，因此ATP-生物发光被用作所有生物污染的快速指示器，但不是特异性的，且灵敏度有限。

最近研发的检测工具是利用核酸杂交的诊断生物传感器。经典的光学检测方法使用标记有荧光基团的特性探针。较新的方法是引入用电活性化学物质标记的DNA链作为信号分子而不是荧光基团。DNA生物传感器具有高度灵敏、快速、廉价、稳定、环境不敏感，并且与微阵列技术兼容的特点。

作为病原体检测的新技术，生物传感器显示出现场实时检测的巨大潜力；然而，需要更好地描述生物传感器是如何受到食品基质和低细菌数量的影响，以及如何区分死和活细胞。在使用实用工具进行原位分析之前，进一步的研究和开发对于发现细胞活力指标和提高生物传感器的特异性和敏感性至关重要。