哺乳动物早期胚胎热休克蛋白70的研究进展

屈平平，李 涛，胡士林

（山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

在哺乳动物胚胎发育早期，如果母体或胚胎受到高温、放射线、活性氧、重金属离子、毒性物质的侵害，则可能导致胚胎细胞超微结构受损；各种细胞器的正常功能被破坏，细胞凋亡增加；胚胎发育潜能降低、发育阻滞、死亡。牛2-细胞期胚胎经过热应激处理后，胚胎线粒体肿胀，卵周隙、核周间隙增大，细胞器从卵胞浆边缘向中央迁移。强热应激组胞浆和核浆空泡化，蛋白质、核内染色质变性，卵裂球表面绒毛减少，溶酶体增多[1]。妊娠1 d母鼠35℃热应激12 h后，大多数胚胎在2-细胞期发育阻滞，发育到囊胚的比例仅为24.3%，受精卵的谷胱甘肽含量显著降低[2]。热应激造成早期胚胎发育阻滞或死亡的现象在各种家畜均可发生，且发生率较高，在人类热应激导致10%～15%的早期流产发生，其中，30%发生在囊胚至着床期[3]。

虽然热应激会对胚胎造成一定的损伤，但胚胎能对热应激做出应答反应，其中，热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）就是应答反应的主要产物之一。大量试验研究表明热环境、重金属（如砷）、缺血、炎症、乙醇、氨基酸类似物、某些临床药物（如水杨酸钠等）、视黄酸类化合物等100多种应激原均可诱导细胞产生大量HSPs，保护细胞结构完整和生理功能正常。HSP70是分子量在68～78 kD之间的一组热休克蛋白，是HSP家族最为保守的一族。HSPs从受精卵开始即有表达，结构型的热休克蛋白70（HSC70）是着床前最主要表达的蛋白。在正常生理条件下，HSC70主要以“分子伴娘”的形式介导其他蛋白正确折叠、组装和分布，参与细胞正常的生长、发育和分化。应激时产生的诱导型热休克蛋白70（HSP70）在囊胚时开始表达，通过分子伴侣作用，增加细胞热耐受性，抑制细胞凋亡等途径保护胚胎免受应激引起的损伤，保证胚胎正常发育。

近几十年来，人们以母体应激和体外胚胎培养为试验模型，利用免疫细胞化学技术、免疫印记、核酸分子杂交、RT-PCR和单、双向电泳等分子生物学技术，从发育学的角度探讨了HSP70与胚胎生长发育和畸形发生的内在联系，并取得大量成果。从国内外的研究趋势上看，HSP70将是今后若干年胚胎发育和致畸领域研究的主要内容之一。

1 HSP70的特性

HSP70为热休克蛋白家族中最为重要、最保守、含量最多的一族，包括68、72、73、75、78 KD等共有21种蛋白质，他们具有相同的酸性等电点和相似的胰蛋白酶肽谱，具有“卷线样”构象段。热休克蛋白70按照其产生的方式可分为结构型热休克蛋白70（HSC70）和诱导型热休克蛋白70（HSP70）2种，二者统称为HSP70。两种热休克蛋白70的氨基酸序列具有90%的同源性，功能也十分相似；但是HSC70和HSP70mRNA表达在时间和空间上有所不同，表达阈值也不同[4]。HSP70具高度的同源性和普遍性，HSP70几乎存在于所有动物的各种组织细胞中，而且不同HSP70 N端2/3部分较C端1/3部分保守的多。正常情况下HSP70在细胞内呈基础表达，表达水平较低，以可溶性的形式存在于胞浆中。当细胞遭受应激，HSP70快速、显著的合成，一般数分钟即可达到最高水平，这是因为HSP70基因不含有内含子，mRNA加工及时，转录快速；在应激条件下，除HSPmRNA以外的mRNA都处于非翻译状态，HSPmRNA的翻译竞争减少。应激时HSP70以高浓度集聚在染色体和核质内，作为瞬间的细胞基质和核基质固定细胞，防止染色质和mRNA复合物降解[5]。而应激消除后细胞处于恢复阶段时，细胞核内的HSP70又返回胞浆，并且在细胞浆内呈低水平表达，再次应激又重新返回细胞核。

2 早期胚胎中HSP70家族的基因类型和表达规律

HSP70由HSP70基因家族HSP70-1、HSP70-2、HSP70-Horn、 HSP70B、 HSP70B'、 HSC70、 GRP78、PBP74、SICTH等编码[6]。HSP70-l和HSP70-2基因的核苷酸有l1处差异，2处位于编码区，HSP70-1基因为热诱导表达，在无热诱导的Hela细胞中有低水平表达。HSP70-2仅限于热休克状态表达，HSP70B基因和HSP70B'基因，为严格热诱导表达，无基础表达。PBP74可以与抗HSP70蛋白抗体结合。热休克蛋白70主要被热休克因子控制，亦与C2fos、C2myc、p53等基因及钙/钙调蛋白、甘油二酯、磷酸肌醇23激酶、cAMP、PKC等生理因子有关[7]。

胚胎发育中合子基因组激活后，热休克基因最先表达，且具有阶段特异性和组织特异性。结构型HSP70在植入前各期小鼠胚胎中均有表达。诱导型的HSP70在胚胎发育到8-cell期时才能检测到[8]。HSP68和HSP70在2-细胞期的小鼠胚胎自发表达，但HSP68的自发表是暂时的，4-cell期即停止，囊胚期后（含囊胚期）HSP68才能被诱导表达。结构型HSC73通常在神经管闭合、神经外胚层分化和增殖过程中有较高水平的表达，位于细胞浆和细胞核内，参与神经元的分化。结构型GRP75和GRP78在胚胎发育阶段也有表达，其中，GRP75定位于小鼠18号染色体[9]。

Christians等[8]证实早在受精卵的单细胞阶段即有HSP70-1mRNA的构成型表达，在两个细胞阶段达高峰，之后表达减少，直到在胚囊阶段成为热诱导型HSP70-1。诱导型、构成型HSP70-2 mRNA在小鼠胚胎中均无表达。在人类的胚胎形成中除了诱导型的HSP70-2/1还有另外1对诱导型的HSP70，即HSP70-6和HSP70-7，他们的序列具有95%的同源性。

3 HSP70对早期胚胎的保护作用

Al-Katanani等[10]在2-细胞牛胚的培养液里加入诱导型的HSP70抗体后发现2-细胞牛胚发育到囊胚的百分率降低。Neuer等[11]用抗鼠HSP70单克隆抗体与2-细胞鼠胚共同孵育，在第5天时发现囊胚孵出率明显降低，结果说明，抗HSP70抗体对鼠胚生长产生强抑制作用。Mirkes等[12]发现过量表达诱导型HSP70的转基因小鼠可以防御由高热引起的胚胎致死效应。还有很多类似的试验证明HSP70对胚胎发育具有保护作用，可能是与HSP70的特殊生物功能有关。

3.1 HHSSPP7700的分子伴侣作用 在生理条件下，HSP70做为分子伴侣，直接参与蛋白质从初生链合成到多亚基复合体折叠、装配的整个生物合成，并参与蛋白质向内质网的易位、参与分解错装的蛋白等，对调节蛋白内环境的稳定具有重要作用。哺乳动物胚胎在应激条件下诱导合成大量的HSP70，而其他蛋白的合成暂时停止或减弱。新合成的HSP70通过在胞质中识别和结合某些未折叠的多肽链，阻止其不可逆的变性和聚集，同时还促进变性蛋白质的降解和清除，重新激活某些酶以维护细胞的功能和生存。应激停止后，HSP70通过ATP供能帮助折叠错误的蛋白质解开，促进其正确折叠和装配。

3.2 HHSSPP7700参与细胞增殖 HSC70位于星体、纺锤体及中心体等有丝分裂装置，在细胞有丝分裂过程中起一定的作用。向鸡胚中加入微量抗HSP70的抗体，随抗体浓度的增加，可破坏有丝分裂装置，阻断细胞分裂，干扰细胞分化[13]。在应激情况下，HSPs可作为细胞周期抑制分子的稳定剂或细胞周期促进分子的抑制剂对细胞周期产生负性调控[14]。热休克蛋白70抗体还能降低精子穿过卵母细胞透明带的能力，干扰受精卵Ⅱ期减数分裂和原核的形成。因此，人们利用HSP70的这种特性，研究HSP70在癌症治疗领域的应用，并取得了一定的成果。

3.3 HHSSPP7700与耐热性 将重组诱导型HSP70基因转入鼠成纤维细胞，发现HSP70表达增加，成纤维细胞对热的抗性增加[15]。Browder比较不同发育阶段海胆胚胎热休克后的发育状况，结果从受精卵到囊胚胎期间的任何阶段都未发现HSP的诱导合成，此期胚胎死亡及异常达99%，但当囊胚期及其以后，热应激可以诱导HSP合成，胚胎成活及正常发育率达99%以上[16]。转基因小鼠耐热性增强，且耐热性的水平与HSP70的表达水平密切相关。说明HSP70能够增加胚胎对热应激的耐受性，因此，将胚胎在温和热环境下进行热休克处理后，可以抵抗更大强度的热应激，提高胚胎在各种热环境下得存活率。

3.4 抑制细胞凋亡 已知许多应激原通过激活凋亡途径从而导致胚胚发育异常，研究发现细胞内HSP70水平增高可以通过阻断信号通路，抑制应激诱导的JNK激活，从而减少细胞的凋亡[17]。向培养液中加入热休克蛋白70抗体后，体外培养的胚胎细胞凋亡增多，囊胚率明显降低，HSP70还能抑制应激激酶P38的活性。所以，在应激状态下，细胞内HSP70家族基因表达增加，可抑制应激激酶激活，防止细胞凋亡。HSP72还可通过抑制线粒体细胞色素C的释放，或直接与细胞内细胞色素C结合，从而阻止caspase的激活，抑制细胞凋亡[18]。HSP70还能抑制氧自由基的产生，直接释放和增加内源性过氧化酶水平，清除氧自由基，减少Ca2+内流所引起的细胞毒性和细胞死亡[19]。

4 目前研究早期胚胎中HSP70的常用方法

4.1 诱导胚胎产生HHSSPP7700的方法 最常用的方法是热应激。

4.1.1 按照热应激的次数分 可分为连续热应激和单次热应激。连续热应激即每天在固定时间对数批孕鼠或胚胎（体外）进行不同温度梯度的热休克处理，连续处理数次，直至预定时间（1-cell期、2-cell期、4-cell期、8-cell期、桑椹胚、囊胚）。然后处死小鼠，取出胚胎，继续体外培养或直接对胚胎进行处理。单次热应激即在胚胎发育的不同阶段，对孕鼠或胚胎（体外）进行一次热休克处理，然后再恢复至正常条件下，待胚胎继续发育一段时间，再对胚胎进行处理[20-23]。

4.1.2 按照热应激的对象分 可分为体外热应激和体内热应激。体内热应激是对母鼠进行热休克处理（一般是把小鼠放在生化培养箱内，设置预定温度，热休克处理一段时间），再将小鼠处死，取出胚胎，进行检测；或对雄鼠进行一定时间的热应激后与正常雌鼠交配，检测胚胎的发育情况。体外热应激是将发育到一定阶段的胚胎取出，培养一段时间后，将CO2培养箱温度调至一定温度，热休克处理一段时间，再恢复至正常或取出胚胎后直接对胚胎进行热应激处理。

4.2 胚胎中HHSSPP7700定性、定量和定位检测 根据热休克蛋白70家族具有相似的等电点，在pH梯度胶中等电聚焦将其分离，然后按照热休克蛋白70家族成员的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳第二次分离，凝胶经图像扫描后，用Image Master图像软件系统分析[24]。核酸杂交技术可以证明HSP70基因是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位[25-26]。原位杂交细胞或组织化学技术，用特殊标记（放射性同位素标记物或非放射性的标记物）核酸探针（DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等），进行了细胞或组织的基因定位[27]。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少，而且还可以对PCR产物进行标记，用于Southern杂交和原位杂交，质粒重组，基因转染等后续试验[28]。这种方法常用于在胚胎中HSP70的研究。

5 HSP70的研究意义

在早期胚胎发育时期，细胞的增殖和分化旺盛，基因表达、蛋白质合成非常活跃，在这个时期，研究胚胎中HSP变化和作用，是探讨HSP70与胚胎生长发育和畸形发生内在联系的重要途径。分子生物学技术的迅速发展，为从分子水平方面揭示胚胎发育正常/异常的奥秘开辟一条新的途径。

[1]Kelley K L,Erdos G W,Hansen P J,et al.Alterations in ultrastructural morphology of two-Cell bovine embryos producedin vitroand in vivoFollowing a Physiologically Relevant Heat Shock[J].Biology of Reproduction,2003,69:2068-2077.

[2]Takaya M,Manabu O,Miho H,et al.Developmental competence and glutathione content of maternally heat-stressed mouse oocytes and zygotes[J].AnimalScienceJournal,2004,75:117-124.

[3]沙伟，刘娣.奶牛早期胚胎死亡原因及分析[J].中国畜牧兽医，2005，32（6）：19-21.

[4]Boshoff T,Lombard F,Eiselen R,et al.Differential basal synthesis of hsp70/hsc70 contributes to interindividual variation in hsp70/hsc70 inducibility[J]. Cell Mol Life Sci,2000,57(8-9):1317-1325.

[5]凌明圣.分子伴侣Hsp70研究进展[J].国外医学一分子生物学分册，1993，l5（5）：227-230.

[6]Feige U and Polla NS.Heat shock protein:the HSP70 famliy[J]. Experentia, 1994(50): 979-986.

[7]Luft JC,Dix DJ.HSP70 expression and function during embryogenesis[J]. Cell Stress Chaperones,1999,4(3):162-170.

[8]Christians E,Campion E,Thompson E M.Expression of the Hsp70.1 gene,a landmark of early zygotic activity in the mouse embryo,is restricted to the first burst of transcription[J].Development,1995,121:113-122.

[9]Neuer A,Spandorfer S D,Giraldo P,et al.Heat shock protein expression during gametogenesis and embryogenesis[J].Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology,1999,7:10-16.

[10]Al-Katanani Y M,Hansen P J.Indcued thermotolerance in bovine two-cell embryos and the role of heat shock protein70 in embryonic development[J].Mol Reprod Dev,2002,62:174-180.

[11]Neuer A,Mele C,Liu H C,et al.Monoclonal antibodies to mammalian heat shock proteins impair mouse embryo development in vitro[J].Human Reproduction,1999,13(4):987-990.

[12]Mirkes P E,Correl L M,Wilson K L.Heat shock protein 70(HSP70)protects postimplantation murine embryos from the embryolethal effectsofhyperthermia[J].DevDyn,1999,214(2):159.

[13]于丽，管英俊.热休克蛋白与胚胎发育[J].解剖科学进展，2002，8（1）：88-91.

[14]刘臣.热休克蛋白与细胞周期调控[J].上海铁道大学学报，2000，21（11）：70-72.

[15]Anderson R L,Van K I,Kraft P E,et al.Biochemical analysis of heat-resistant mouse tumor cell strains:a new member of the HSP70 family[J].Mol Cell Biol,I989,9(8):3509-3516.

[16]王枫.热休克蛋白与热耐力研究进展[J].国外医学：卫生学分册，1997，24（2）：65-67.

[17] Mosser D D, Caron A W, Bourgent L. The chapercne function of hsp70 Is required for protection against stress-induned apoptosis[J].Mol Cell Biol,2000,20:7146-7159.

[18]李洪，刘桥义，杨天德.热休克蛋白的抗凋亡作用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2000，12（3）：117.

[19]冯刚.应激反应的细胞损伤和抗损伤机制及其调控[J]. 创伤外科杂志，1999，1（1）：51-53.

[20]Manabu O,Yukiko Y,Miho H,et al.Viability of maternally heat-stressed mouse zygotesin vivoandin vitro[J].Animal Science Journal,2003,74:181-185.

[21]Zhu B,Walker S K,Oakey H,et al.Effect of paternal heat stress on the developmentin vitroof preimplantation embryos in the mouse[J].Paternal heat stress and embryo development,2004,36:384-394.

[22]Zhu Band Maddocks S.The effect of paternal heat stress on protein profiles of pre-implantation embryos in the mouse[J].International Journal of Andrology,2005,28:128-136.

[23]Rivera R,Mand Hansen P J.Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in the physiological range[J].Reproduction,2001,121:107-115.

[24]Jesus A G,Vince G J.Chemical modifications of a recombinant bovine stress-inducible 70 kDa heat-shock protein(Hsp7O)mimics Hsp7O isoforms from tissues[J]. Biochem, 1995,305:197-203.

[25]C-H Liu,C-C Yang,DP-C Lin.Stored of Hsp72/Hsp73 in Germinal Vesicle-stage Mouse Oocytes[J].Reprod Dom Anim,2004,39:19-24.

[26]Christine L,Michel T,Robert S.Expression of heat shock protein 70 in normal and cryptorchid human excurrent duct[J].Mol Hum Reprod,2004,10:197-202.

[27]Lee J S,Jeong S S.HSP70 deficiency results in activation of c-Jun N-terminal Kinase,extracellular signal-regulated kinase,and caspase-3 in hyperosmolarity-induced apoptosis[J].Biol Chem,2005,280:6634-6641.

[28]Chandolia R K,Peltier M R,Tian W.Transcriptional control of development,protein synthesis,and heat-induced heat shock protein 70 synthesis in 2-cell bovine embryos1[J].Biology of Reproduction,1999,61:1644-1648.