真菌毒素检测技术研究概述

◎ 李晓丹

（德宏州质量技术监督综合检测中心，云南 德宏 678400）

真菌毒素是由真菌产生的具有毒性的次级代谢产物，广泛污染农作物、食品及饲料等产品。被发现并报道的真菌毒素主要有黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）、 赭 曲 霉 毒 素（ochratoxin，OT）、 橘 霉 素（citrinin）、展青霉素(patulin，Pat)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxvnivalenol，DON）和伏马毒素（fumonisin）等。真菌毒素的特征主要表现在污染的广泛性、危害的严重性上。真菌毒素直接的危害是毒素的暴露而引发急性疾病或许多慢性症状，如生长减慢、免疫功能下降、抗病能力差以及肿瘤的形成等。目前，真菌毒素的检测方法主要有化学分析法、仪器分析法和免疫分析法等[1]。

1 主要真菌毒素介绍

1.1 黄曲霉毒素

黄曲霉毒素是结构相似的一大类化合物，常由黄曲霉及另外几种霉素在霉变的谷物中产生，是目前为止最强的致癌物质。黄曲霉毒素以AFB1的毒性最强。黄曲霉毒素急性中毒时，可发生肝胆病变，严重的甚至可导致死亡；慢性中毒时表现为致癌性和免疫抑制等作用[2]。Soni P等[8]发现黄曲霉毒素通过遗传和非遗传途径诱导多种效应，从而改变宿主细胞的功能。AFB1调节多个表观遗传调节器，结果显示AFB1对多基因表观调制的影响是已知的关键致癌过程。主要检测方法有液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱、免疫分析法和薄层色谱法[2][6][7]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是由曲霉属和青霉属的某些霉菌产生的真菌毒素，主要有7种结构类似物，对人类的健康有影响的主要是OTA、OTB和OTC[3]。赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素之后又一引起世界各国广泛关注的真菌毒素，主要出现在谷物、豆类、咖啡、葡萄以及饲料中，由于毒素蓄积残留，也会出现在牛奶和肉类中。主要检测方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法和薄层色谱法[6][7]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素。主要污染玉米、大麦、高粱、大米和小米等，其中以玉米的检出率和含量最高。ZEN具有雌激素，主要作用于生殖系统，可使家畜、家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物食用含有ZEN的饲料可引起流产、死胎和畸胎。主要检测方法有液相色谱法、荧光光度法、液相色谱-质谱法、免疫分析法[2][7]。

1.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇

脱氧雪腐镰刀菌烯醇又被称为“呕吐毒素”，是镰刀菌在谷物生长过程中产生的次级代谢产物。DON在谷类作物中含量最高，啤酒、鸡蛋、牛奶、肉类等农副产品也有检出。其在食品和环境中广泛分布，通过食物链的传递对人类和动物的健康产生巨大威胁。主要表现为呕吐、消化紊乱等。DON污染引发的食品安全隐患表现在其污染的广泛性，此外还有细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性以及致畸性和致癌性等。主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、薄层色谱法、免疫分析法、气相色谱法[2][6][7]。

1.5 伏马毒素

伏马毒素是由镰刀菌属在一定温度和湿度下产生的水溶性代谢产物。伏马毒素在全球广泛分布，主要分布在以玉米、高粱、小麦为主的农作物上，造成农业经济损失。到目前为止，发现的伏马毒素有11种，主要以FB1、FB2、FB33种形式存在，其中以FB1危害范围最大、毒性最强。伏马毒素对植物代谢有毒害作用。伏马毒素还是一种慢性促癌剂，并能引起灵长类动物的动脉粥样硬化。主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法[2][5][7]。

1.6 麦角生物碱

麦角生物碱简称麦角碱，是由麦角菌属侵害黑麦、大麦、小麦、裸麦、燕麦等禾本科植物而产生的生物碱毒素。麦角毒素的毒性效应主要是外周围和中枢神经效应，中毒症状表现为坏疽性中毒和痉挛性中毒[2]。主要检测方法有气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法[2][4]。

1.7 展青毒素

展青毒素又名棒曲霉毒素，是一类由曲霉和青霉等真菌产生的次级代谢产物，具有影响生育、致癌、致畸和免疫等毒理作用，也是一种神经毒素。广泛存在于各种霉变水果和青贮饲料中。主要检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和免疫分析法[2][3]。

1.8 其他类真菌毒素

1.8.1 橘霉素

橘霉素（Citrinin，CIT）主要由青霉属、曲霉属产生，是具有肾毒性、致畸性、致癌性和致突变性的次级代谢产物。主要检测方法有薄层色谱法、免疫分析法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法[7]。

1.8.2 T-2毒素和HT-2毒素

T-2毒素和HT-2毒素是由多种真菌产生的单端孢霉烯族毒素。T-2毒素具有高毒性，人体吸入时会急性中毒。主要检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和免疫分析法[6][7]。

1.8.3 杂色曲霉素

杂色曲霉素（sterigmatocystin）是一类结构类似的化合物，主要由杂色曲霉和构巢曲霉等真菌产生，杂色曲霉主要污染谷物，杂色曲霉素主要表现为肝、肾中毒，具有强致癌性。主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法、免疫分析法、化学传感器分析等[7]。

1.8.4 白僵菌素

白僵菌素（beauvericin，BEA）是镰刀菌属真菌产生的六酯肽类真菌毒素，可致畸、致突变等。Mallebrera B[21]等综述了最新的研究表明BEA是具有遗传毒性的，产生DNA断裂、染色体畸变，并通过线粒体途径参与细胞凋亡。主要检测方法有常规液相色谱-串联质谱法和高效液相-串联质谱法。

1.8.5 链格孢霉菌类毒素

链格孢霉菌是除曲霉、青霉和镰刀菌以外的另一种重要的产毒菌。链格孢霉菌产生的多种次生代谢产物对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性。链格孢霉毒素中目前研究比较有代表性的毒素是AOH、AME和TeA。链格孢霉毒素中常用薄层色谱法、气相色谱及气质联用技术、液相色谱及液质联用技术和用于快速检测的酶联免疫分析[18]。Puntscher H等[25]介绍了一种含有17种毒素的LC-MS/MS方法，用于研究番茄酱、葵花籽油和小麦粉中游离和修饰链格孢毒素的自然发生。所建立的多重分析方法适用于不同食物基质中产生链格孢毒素。

1.8.6 恩镰孢菌素

恩镰孢菌素（enniatins，ENNs）和白僵菌素一样，是由镰刀菌属的某些真菌产生的真菌毒素，目前已发现了20多种恩镰孢菌素，食品中最常见的主要 是 ENA、ENA1、ENB、ENB1。Manyes L 等[22]研究Jurkat T细胞用于研究白僵菌（BEA）和enniatin B（EnNb）的毒性作用。韩小敏等[19][20]对BEA和ENNs的研究进展进行综述并开发了同时检测BEA和ENNs的仪器分析方法。主要检测方法有常规液相色谱-串联质谱法和高效液相-串联质谱法[19]。

2 真菌毒素检测技术研究进展

2.1 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）是真菌毒素的传统检测方法，样品经提取、浓缩、薄层分离后，在紫外光照射下观察其荧光特性，定性定量。薄层色谱法操作过程繁琐复杂、溶剂消耗大、对实验人员要求高、重现性低、灵敏度低，目前该方法已逐步被其他方法取代。

2.2 气相色谱法及气相色谱-质谱法

气相色谱和气相色谱-质谱法常用于分析热稳定、容易汽化、分子中不含发色基团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收的真菌毒素。真菌毒素中采用气相色谱法检测主要是单端孢霉烯族类化合物，由于待测目标物不易挥发，样品经净化处理后需进行衍生化将其转化为低沸点的衍生物，较为耗时费力。

2.3 高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱法

高效液相色谱和高效液相色谱-质谱法是目前食品中污染物监测方法中适用范围最广泛、使用频率最高的分析方法。具有稳定可靠、灵敏度高的特点，适用于大多数真菌毒素，可实现对多种真菌毒素的定量检测。既具备了高效液相色谱的高分辨率，又可以发挥质谱的高鉴别能力，净化要求低、灵敏度高、可以同时进行多组分分析，能够同时鉴别不同种属的真菌毒素。Jiang K等[16]通过改进SPE的吸附剂，同时进行 牛 奶 中 AFB1、AFM1、OTA、ZEA、α-ZOL、β-ZOL的纯化和富集，并用高效液相色谱-串联质谱技术对牛奶中的6种目标化合物进行检测。Carballo D等[23]用高效液相色谱-串联质谱法同时分析即食食品中27种真菌毒素，包括黄曲霉毒素（B1，B2，G1，G2）、恩镰孢菌素（A，A1，B，B1）、BEA、FB1、FB2、杂色曲霉素、DON、3-ADON、15-ADON、玉米赤霉烯醇、T-2毒素和HT-2毒素等。该方法成功地应用于25份即食食品样品的分析。真菌毒素主要检测在谷物、蔬菜和豆类制备的即食食品样品中。Shao M等[24]运用利用LC-MS/MS研究狗粮中最常见的真菌毒素的发生情况。

2.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

Jerome Jeyakumar JM等[11]采用高效液相色谱、液相色谱-电喷雾串联质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对镰刀菌感染甘蔗进行了评价。建立了一种简便、灵敏、可靠的快速检测镰刀菌属8种真菌毒素的方法：FB1和FB2、DON、尼伐烯醇、3-ADON、15-ADON、ZEN和AFG1。在两个主要产物离子的多反应监测模式下进行了分析。LC/MS和MALDI-TOF MS/MS所产生的结果揭示了调节真菌毒素产生的各种机制，这有助于阐明敏感和选择性化合物的作用。

2.5 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原抗体反应原理对真菌毒素定性定量检测的分析方法，具有简单、灵敏度高、迅速等特点，可用于真菌毒素的大批量初筛。在真菌毒素检测方法中常用的有酶联免疫分析法以及近年来发展比较迅速的免疫胶体金技术和免疫芯片技术。酶联免疫吸附测定法（ELISA）具有特异性强、灵敏度高、前处理简单、易于推广等优点，特别适合大量样品中真菌毒素的检测。但ELISA具有一定的假阳性，在检出阳性时需进一步确证。

2.6 生物芯片分析法

生物芯片是近年来在生命科学领域迅速发展起来的高新技术，具有大规模、高通量和高平行的特点，是当今世界的前沿学科和研究热点。Man Y等[13]综述了生物芯片在真菌检测方面的运用。

2.7 其他新型方法

2.7.1 生物传感器

生物传感器是基于抗原抗体的高度亲和作用，运用电化学科技将毒素的相互作用转换成信号进行测定。Jalalian SH等[10]研制了一种检测AFM1的新型电化学传感器。APTASSER允许检测AFM1，检测限为0.9 ng/L。APTASSER传感器成功地应用于实际样品中AFM1的检测，包括牛奶和血清样品。Ma C等[12]描述了一种荧光检测OTA，该方法对OTA具有高度选择性。生物传感器法目前处于实验室研究阶段。

2.7.2 核酸适配体

基于适体的结构转换特性，Li Y[9]等报道了适配体荧光法检测AFB1。AFB1的检出限达到0.2 nm。该方法能够检测复杂样品基质中的AFB1，例如稀释的葡萄酒样品和玉米粉样品。这种基于适体的荧光法测定AFB1具有广阔的应用前景。核酸适配体主要是基于核苷酸识别原件，同抗体比较具有差异小、纯度高、性质稳定、耐高温等优势，目前并没有商品化的核酸适配体，但是凭借其众多明显优势，有望在真菌毒素快速检测方面发挥作用。

2.7.3 光波导模式谱

Adányi N[14]等运用光波导光模式光谱（optical waveguide lightmode spectroscopy, OWLS）应用于竞争AFB1的检测，通过增加金的固定表面来增强信号表面。制备不同尺寸和来源的纳米颗粒（通过化学或生物技术合成），观察了AuNPS中粒径、方法和生化参数对免疫传感器性能的影响。在优化敏化传感器表面后，采用免疫传感法对辣椒红色素中的黄曲霉毒素进行了分析，并与HPLC测定结果进行了比较。

2.7.4 分子印迹聚合物分析

ELISA已被用于监测FB1的食品和动物饲料污染的标准工具。ELISA并不总是有效的，因为抗体和酶组分在免疫分析中的不稳定性、样品中天然酶抑制剂的存在和非特异性蛋白结合的高水平。此外，由于动物在制造过程中的参与，ELISA抗体的生产可能耗时和昂贵。为了克服这些限制因素，已经开发了分子印迹纳米粒子为基础的分析（Molecularly imprinted polymer nanoparticle-based assay, MINA），Munawar H等[15]设计分子印迹纳米颗粒（NANOMIP）取代在竞争ELISA中使用的一级抗体。在样品中测定是高度特异性的，并且不与其他真菌毒素（FB2、AFB1、CTT、ZEA和DON）交叉反应性。

3 结语

真菌毒素具有毒性并且广泛分布，对人类和家畜造成危害。本文就目前主要造成危害的真菌毒素进行了简介，并阐述了目前常用的真菌毒素检测方法及进展。对真菌毒素的检测主要集中于快速检验的筛查技术以及多种真菌毒素的同时检测，随着真菌毒素检验技术研究的进一步深入，食品安全性将得到更好的保障。