哺乳动物妊娠中miRNA的作用

韩志强,宋兴超,王海军,贾 赟,赵家平,赵全民,邢秀梅,徐 超*

(1.中国农业科学院特产研究所，农业部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室，吉林省特种经济动物分子生物学省部共建国家重点实验室,长春 130112； 2. 吉林农业大学，长春 130118；3. 吉林省野生动物救护繁育中心，长春 130119； 4.辽宁出入境检验检疫局技术中心,大连 116001)

miRNA是一类小的非编码RNA，广泛存在于动物的血清、血浆、唾液、初乳、腹膜液、精液、卵泡液等生物体液中，并在人和许多动物的生理(怀孕)和病理过程中起着关键作用。miRNA具有调节基因表达的功能，在基因表达中起着“微调”而不是“开关”的作用，并与多种细胞的代谢、分化、增殖和凋亡过程有关[1]。1997年Lo等[2]证实了母体血液中存在着部分的胎儿游离核酸，2000年Poon等[3]在母体血浆中检测到游离胎儿RNA，2008年Chim等[4]在人体血液中检测到妊娠特异性miRNA。同一物种血清中的胎盘miRNA水平在个体之间具有高度相似性[5]。由于血浆中存在的miRNA比mRNA更稳定[4]，所以母体血浆中胎盘miRNA的含量可作为监测胎盘基因调控的重要依据。除了血液，胎盘亦是miRNA高度富集的器官之一[6]，动物胎盘功能和动物妊娠与胎盘中的特异性miRNA簇具有十分重要的关系[7-9]。miRNA参与胚胎着床前子宫内膜的发育[10]，调节炎症反应及免疫耐受相关基因在怀孕开始与维持过程中的表达。

1 妊娠相关的miRNA簇

目前为止，已报道了600余种miRNA在人体胎盘的动态表达。胎盘miRNA可通过3个miRNA簇内的多种miRNA来表达，其中包括C14MC簇(chromosome 14 miRNA cluster, C14MC)、C19MC簇(chromosome 19 miRNA cluster, C19MC)以及miR-371-3簇[11-12]。特别是怀孕期间，妊娠相关胎盘miRNA 簇的表达量在不断发生着变化[11, 13]。血液中的胎盘miRNA 主要来源于绒毛滋养层。miRNA 簇广泛存在于母体血液循环中，所以对动物妊娠诊断来说具有极大的应用潜力。

1.1 C14MC簇

C14MC又被称为Mirg簇[14]、miR-379/miR-410簇或miR-379 / miR- 656簇[15]，包含约52个miRNA基因(产生63个成熟miRNA)[11-12, 16]。C14MC簇在真哺乳亚纲物种中是保守的，仅由母本遗传的等位基因(父本等位基因被甲基化)表达，并且主要在发育中的胚胎(头和躯干)和胎盘组织表达，也在滋养层细胞高度表达[17]。C14MC簇具有促进哺乳动物胎盘进化的作用[15]。

1.2 C19MC簇

C19MC簇位于19号染色体上，是迄今为止人染色体上最大的miRNA基因簇之一。C19MC属灵长类动物的特异性miRNA家族，大鼠、小鼠以及狗的体内并没有发现该miRNA簇的同源物[18]。C19MC簇包括了46个miRNA(产生58个成熟miRNA)[17]。与C14MC簇类似的是，C19MC簇也位于印迹基因内，与C14MC相反的是，C19MC受17.6 kb上游CpG启动子区甲基化控制，仅由父本遗传等位基因表达[19]。印迹基因在细胞分化和命运的调控中具有重要作用，并且它们大都仅在胚胎期或胎盘组织中表达。C19MC的表达主要受生殖系统和胎盘的影响[13]。研究表明，C19MC簇在胚胎发育中具有重要的作用，妊娠早期许多外周体液中C19MC簇miRNA表达量升高[20]。

1.3 miR-371-3簇

miR-371-3簇主要由hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-372和hsa-miR-373-3p产生的6个成熟RNA组成的。miR-371-3簇共享着相同种子序列“AAG UGC”，并且该共享相同种子序列miRNA超家族还包括小鼠同源物簇miR-290-295[9]。miR-371-3簇位于与C19MC簇下游约25 kb的1 050 bp区域内[21]。与C14MC簇和C19MC簇类似的是仅在哺乳动物中高度保守，并且在胎盘中优先表达[22]。现已证明，miR-371-3簇是调节细胞增殖和凋亡必需的miRNA[23]，因此对胚胎发育具有重要的作用。

对哺乳动物中人miRNA分析显示，C19MC簇、C14MC簇和miR-371-3簇在胎盘组织中高度表达，并且其表达随胎龄变化而变化[24]。C14MC簇和C19MC簇的水平在整个怀孕期间也不断地发生变化。C14MC簇在第一孕周的滋养层细胞中高度表达，但在妊娠中期减少。与C14MC簇相反，C19MC簇在妊娠前期表达较低，但在妊娠末期高度表达。妊娠终止后，受胎盘影响C14MC簇和C19MC簇妊娠相关的miRNA表达水平显著下降[11, 25]。胚胎与血液中的miRNA的变化反映并维持着动物机体妊娠进程，以miRNA鉴定为基础进行妊娠研究会是未来发展的大趋势。

2 miRNA与早期妊娠诊断

早期妊娠诊断是哺乳动物繁殖管理的重要环节，其对于提高动物妊娠率尤为重要[26]。循环miRNA则对妊娠诊断具有潜在的预测性、特异性、敏感性，并且能以非侵入性的方式获得，其检测效率也相对较高[27-28]。Ioannidis和Donadeu[29]首次确定了牛早期妊娠期间血浆中miRNA的变化水平，发现了 10个 最丰富的miRNA，即bta-miR-133a、bta-miR-486、bta-miR-22-3p、bta-miR-19、bta-miR-191、bta-miR-423-5p、bta-miR-10b、bta-miR-142-5p、bta-miR-27b和bta-miR-30d，占总miRNA量的61%，其中，怀孕母牛第16天miR-133a表达水平比同期非怀孕小母牛高出7.4倍，并发现在怀孕16～24天期间miR-26a水平升高2倍以上。Ioannidis和Donadeu[30]进一步研究发现，最早可在牛妊娠第8天 检测到miR-26a的水平明显增加，另外，第16天 与第8天相比miR-101的水平也趋于升高。近期在猪和羊的研究中也发现，妊娠第20天时miR-26a在受孕卵巢中的表达水平出现增加[31-32]。在怀孕羊中还发现，miR-30c、miR-132、miR-379、miR-199a-3p和miR-320也出现差异表达。另有研究提出，bta-mir-140可作为早期妊娠诊断的分子生物标志物[33]，这为研究者们通过miRNA进行早期妊娠诊断提供了新的依据。近年来，诸多学者提出通过对奶中miRNA 谱高通量测序分析进行妊娠诊断也具有十分重要的意义[34]。miRNA广泛存在于血液[35]、唾液[36]、尿[37]和牛奶[38]等多种动物体液中，这些体液中的miRNA将来均有望成为研究妊娠诊断理想的分子标志物。

3 miRNA与妊娠相关疾病的关系

miRNA除了在正常妊娠中发挥作用，其动态调节基因表达的能力也有助于妊娠相关病症的诊断，包括先兆子痫、异位妊娠、复发性流产、早产和胎儿宫内发育迟缓等[39]。虽然怀孕期间miRNA作为标志物的鉴定仍处于初期阶段，但现在已经筛选出了许多具有研究意义的miRNA。现阶段对于除人外的哺乳动物妊娠疾病与miRNA研究较少，以下主要讨论人常见怀孕异常引发的疾病与miRNA 特征性关系。

3.1 miRNA与先兆子痫的关系

先兆子痫(preeclampsia，PE)是指在哺乳动物妊娠后半期、分娩期或分娩后期出现高血压、蛋白尿或其他系统疾病的一种妊娠相关综合征[40]。PE在人中发病率高达8%[41],然而PE在妊娠早期症状并不明显，很难进行诊断，因此寻找某种鉴定早期PE的方法至关重要。有研究表明，miRNA可参与PE的发病机制[42]。Ishibashi等[43]对人正常胎盘和PE胎盘之间的miRNA进行大规模高通量测序，筛选出了先兆子痫胎盘中显著上调的22种miRNA，为研究先兆子痫提供了有力依据。Yang等[44]研究发现，PE患者妊娠前3个月miRNA表达量有15个 上调，7个轻度下调。其中严重PE患者血浆中的miR-24、miR-26a、miR-103、miR-130b、miR-181a、miR-342-3p和miR-574-5p表达量升高。Loux等[45]在孕马体内发现，与PE有关的miR-204b和hsa-miR-204表达上调。De Bem等[46]证明，妊娠奶牛血液中hsa-miR-26a水平增加与妊娠有关，这种miRNA与先兆子痫相关。先兆子痫的发生可能是由母体和胎儿-胎盘循环中的血管内皮功能障碍引起的，这种功能障碍会引起包括调节血管张力、膜转运功能、内皮存活或增殖、血管生成和代谢途径等相关miRNA表达量发生改变。

3.2 miRNA与异位妊娠的关系

异位妊娠(ectopic pregnancy，EP)是指孕卵在子宫腔外着床发育的异常妊娠过程，也称“宫外孕”，孕妇发病率为1%～2%[47]。现阶段EP检测主要有两种方法，一种是阴道超声检查，但是经阴道超声不能准确地确定EP；另一种是通过检测母体血清中的人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕酮浓度，然而，通过血HCG和孕酮浓度对EP的诊断方法易产生假阳性和假阴性结果[48]。因此寻求一种快速、准确鉴定异位妊娠的方法至关重要。Zhao等[48]为了寻找可以更准确、敏感地鉴定人的异位妊娠生物标志物，比较了发生自发流产(spontaneous abortion,SA)和正常妊娠(normal pregnancy,NP)的EP患儿血清样本中妊娠相关miRNA的表达，结果显示，EP或SA与NP相比，miR-517a、miR-519d和miR-525-3p的表达量较低，而miR-323-3p表达量明显高于EP。Lu等[49]研究发现，SA和EP患者与正常孕妇相比，血清miRNA中的5种miRNA(miR-218、miR-233、miR-141、miR-873和miR-323)出现差异表达，并且miR-873作为单一标记具有最高的灵敏度，EP检测率高达61.76%。虽然对于miRNA异位妊娠研究较多，但现阶段利用miRNA来检测异位妊娠还不成熟，还需进一步筛选特异性标志物，通过HCG和孕酮与miRNA结合评估可以提高miRNA 作为生物标志物的诊断性能，也可以提高异位妊娠的总体诊断效率。

3.3 miRNA与早产的关系

人早产(premature delivery，PTD)分娩的定义为在妊娠37周之前的分娩。对于除人外的哺乳动物来说，妊娠时间各有差异，因此对于早产的时间定义也有所不同。研究发现，PTD患者中miRNA出现了差异表达[50-51]。Enquobahrie等[50]发现，人早产与miR-210和mir-223的含量增加相关。Pineles等[51]进行了miRNA微阵列分析，发现人绒毛膜中的39个miRNA在术前和早产组之间相比出现差异表达，miR-338、miR-449、miR-136和miR-199a表达出现下降。Mayor-Lynn等[52]分析了人早产和正常胎盘之间的miRNA表达谱，发现了20种差异表达miRNA，在早产孕妇胎盘中miR-15b、miR-181a、miR-210、miR-296-3p、miR-483-5p和miR-493等许多miRNA出现差异表达。Gray等[53]则证实，人母体血浆中miR-223表达升高与自发性早产相关，并认为miR-223有望成为早期预测自发性早产的miRNA生物标志物。另外，怀孕早期外周血中miRNA的定量分析对自发性早产的敏感和特异性预测也具有较高价值[54]。

4 miRNA与母乳的关系

母乳中含有丰富的分泌型免疫球蛋白和双歧因子，具有提高动物免疫力、促进动物生长、降低动物幼崽发病率和死亡率的作用，对于新生哺乳动物幼崽来说至关重要。miRNA与催乳素生成途径相关，能够参与乳汁合成的生理过程[55]。现在有超过1400种成熟的miRNA在人乳中表达[56]，人乳中还含有丰富的免疫相关miRNA[56-57]。牛乳中的一些miRNA与神经系统通路有关，并可能介导大脑发育，如miR-118-2靶向了神经系统中丰富的蛋白神经元跨膜蛋白[58]。人乳中的一些miRNA还具有组织特异性[59]，如miR-142-5p具有造血特异性[60]。人乳中miRNA还可能促进婴儿特定器官和组织的发育。此外，牛乳中miRNA与牛奶代谢途径相关，如let-7家族大量存在于牛奶中，参与了葡萄糖代谢，并可调节葡萄糖耐受量和胰岛素敏感性[58-59, 61]。另外，有研究发现，miRNA-148a在人乳中高度表达，并且miRNA-148a在白血病中表达较少，由此可推测，母乳中miRNA-148a等miRNA可能对儿童白血病具有保护作用[62]。值得注意的是，牛乳成分(包括miRNA)的昼夜变化可能对幼畜胃肠昼夜节律性的建立和调整有益[59]。

5 展 望

众多研究表明，miRNA与妊娠过程中的胚胎发育、妊娠疾病诊断及产后哺乳存在一定的关系。现阶段miRNA参与妊娠的多数功能是通过表达模式推测的，但尚未在多数哺乳动物中进行细致的功能研究，并且大都是通过采取部分组织或体液进行检测，并不一定能完全反映其在动物体内的正常生理水平。若miRNA作为怀孕功能验证的诊断工具，其快速精确的诊断特点对妊娠来说是不可或缺的，未来将miRNA应有到妊娠诊断时要注重对其稳定性进行深入探究。随着互联网技术和生物学检测手段的不断发展，miRNA在哺乳动物妊娠过程中的调控功能也会逐渐明晰，必将助力于畜牧与医药行业的发展。