Wnt3a与Wnt5a信号途径转换对造血干细胞衰老的影响

李 双，孙倩倩，余丽梅*，赵春华

(1.遵义医学院附属医院 贵州省细胞工程重点实验室, 贵州 遵义 563003；2.贵州省羊膜与骨髓干细胞基础与临床研究科技创新人才团队, 贵州 遵义 563003； 3.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 中国医学科学院组织工程研究中心 干细胞新药研发及临床转化研究北京市重点实验室，北京 100005)

衰老(aging or senescence)通常是指生物体发育成熟后，正常情况下随着年龄的增加，体内各器官、组织和细胞逐步发生不可逆转的、全面的结构和功能衰退，并且随着进程推移和不断发展，出现不可避免的机体死亡[1]。衰老过程中的变化主要体现在机体组织细胞和构成物质丧失，代谢率减缓，组织器官功能减退，如造血免疫功能衰退等，表现出血细胞数量和比例改变，免疫细胞分化偏移，机体免疫防御、免疫监视和免疫自稳功能降低等，从而导致衰老相关疾病如肿瘤、感染等发生明显增加。衰老的机制除涉及氧化应激、DNA损伤、蛋白质组稳态改变、线粒体功能失调、细胞微环境变化、端粒缩短与端粒酶活性降低外，还与下丘脑—性腺—性激素功能平衡紊乱和表观遗传学改变及免疫炎性反应等有关[2- 5]。越来越多的研究表明，机体衰老的实质为干细胞衰老，造血干细胞(haematopoietic stem cell，HSCs)衰老为其主要原因之一；显然，延缓或阻止HSCs等成体干细胞衰老，不但可维持机体的正常功能，还可减少相关疾病的发生；深入了解 HSCs 衰老的分子调控机制，不仅有助于HSCs 数量及功能稳态的维持，对理解 HSCs 衰老及其相关疾病的发生亦非常重要，对于发现HSCs 衰老及其相关疾病的新靶点、研发治疗新策略都十分有益，因此，本文主要综述了HSCs衰老的生物学特征和功能变化，并重点阐述了非经典Wnt3a通路向经典Wnt5a通路转换对HSCs衰老的影响及调控机制。

1 HSCs衰老的主要表现与影响因素

HSCs 具有自我更新和多谱系分化潜能，是造血、免疫组织器官保持年轻的重要基石。与年轻小鼠比较，老年鼠骨髓中向髓系分化的HSCs比例增高，而向淋系分化的HSCs比例下降，HSCs的自我更新能力下降；Lin-Sca- 1+Kit+CD34low/-Flk2-HSCs的长期增殖潜能明显降低。移植试验中，衰老的HSC骨髓归巢能力下降，出现明显延迟的增殖反应，从而表现出贫血、免疫功能衰退等造血系统衰老的特征性表现[4]，这也较好地解释了老年个体易患感染类疾病、免疫力低下及免疫接种成功率低的缘由。

诸多研究表明，衰老过程中造血系统的基本成分得以维持，但HSCs的数量和质量却逐渐降低，HSCs衰老主要表现为细胞体积变大，自我更新能力减弱和分化功能异常，黏附能力增加，HSCs归巢至骨髓能力减弱，迁移到外周血能力增强；凋亡和细胞内β-半乳糖苷酶染色阳性颗粒增加，细胞增殖周期阻滞，可逆地停留于G1期；机体的免疫系统包括淋巴细胞功能下降，甚至表现出骨髓衰竭、贫血、免疫力低下，乃至产生白血病等衰老相关疾病，并可见Wnt、FGF、p16INK4a和SIRT6等重要信号分子表达的改变[6]。

除了复制性衰老，DNA 损伤累积可导致HSCs 衰老及其功能下降[7]；端粒酶基因敲除小鼠的HSCs 体外克隆形成能力和体内造血重建能力均显著下降，提示端粒缩短也可影响HSCs的自我更新能力；但端粒酶与p21 双基因敲除后， p21 基因表达的降低可以改善HSCs 的自我更新能力[8]。在HSCs 衰老与抗衰老的过程中，构成HSCs 微环境的局部细胞因子如干细胞因子、基质细胞衍生因子、促血小板生成素及Notch 信号、血管生成素、Wnt信号分子等都参与了HSCs增殖、分化及衰老的发生、发展[9]。此外D-半乳糖、白消安、间充质干细胞连续传代、放射性损伤等都可诱发HSCs衰老，也可能涉及HSCs自身的基因突变及表观遗传学改变[10]。

2 Wnt信号通路

在HSCs及非造血的基质细胞中，有丰富的Wnt家族成员的表达，经典Wnt通路和非经典Wnt信号途径的激活都可以启动细胞内信号传导途径，调控细胞增殖、分化、衰老、凋亡、迁移及细胞极性改变等生物学行为及其细胞命运决定[11]。在经典Wnt3a/β-catenin信号通路中，Dally/Kny可促进Wnt的招募，Wnt与Frizzled(Fz)受体和LRP5/6受体结合，Fz结合Dvl，经GSK3和CK1γ和CK1等，Fz-LRP6复合物中LRP6磷酸化，促进Axin招募，并与去磷酸化β-catenin结合，稳定的β-catenin集聚增加，转位到细胞核，与细胞核内T细胞因子/淋巴增强因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，LEF/TCF)转录因子结合，启动下游如c-myc、cyclin D1等靶基因转录。cyclin D1是细胞周期增殖信号的关键蛋白，为细胞周期从G1期到S期转换所必须，当β-catenin在胞质内积累时，进入细胞核与LEF/TCF结合，激活cyclin D1基因转录，促进细胞增殖。c-myc基因的转录水平反应组织细胞的增殖状态，其启动子上有TCF4结合位点，能与β-catenin结合，从而加速G1到S期的转变，促进细胞分化增殖，同时可启动Wnt3a信号通路抑制Dkk1和Axin2的表达，而发挥负反馈调控作用。此外，β-catenin也可结合转录因子蛋白Prop1和Pitx2，而共激活非TCF/LEF靶基因转录[12- 13]。在没有Wnt配体的情况下，由Axin、GSK3β、APC和其他蛋白质组成的复合物可以促进细胞衰老中Wnt通路的关键信号分子β-catenin磷酸化，并将β-catenin泛素化后降解。

非经典Wnt信号通路中，Wnt蛋白主要包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8和Wnt11，分别通过Wnt/Ca2+、Wnt/PCP、Wnt/RAP1、Wnt/ROR2、Wnt/PKA、Wnt/GSK3、Wnt/aPKC等途径启动下游靶基因转录，或作用于Actin，影响细胞骨架结构，调控细胞极性，或经Wnt-GSK3-MT、Wnt-aPKC、Wnt-RYK、Wnt-mTOR影响微管蛋白生成、细胞趋化等。其中Wnt/Ca2+和Wnt/PCP途径激活时，均由Wnt经Fz受体结合，激活细胞膜上的G蛋白及与之偶联的Dvl后，Wnt/Ca2+途径经PLC/DAG/PKC，引起细胞内Ca2+浓度增加，激活PKC/Cdc42作用于actin，影响细胞骨架，改变细胞极性、黏附和迁移等发挥作用，也可经CaMKII/TAK1/NLK，阻断β-catenin与TCF/LEF的结合；或使CAN磷酸化后，启动靶基因NF-AT等转录；也可经PDE6/PKG，阻滞细胞内Ca2+水平增高；Wnt5a与Fz结合后，经MKK3/6导致的p38活化，除启动ATF2等下游基因转录外，也为PDE6产生活性作用所必须。而Wnt5a或Wnt11/PCP途径则经Dvl-RhoA-Daam1复合物，激活Rock激酶和使MRLC磷酸化，Dvl-Rac1复合物则激活JUK激酶，使CapZIP/Dub磷酸化，最终通过Dvl的多种途径，影响激动蛋白细胞骨架，参与细胞极性调节，或启动c-JUN等基因转录[14]。由非经典Wnt5a信号途径激活导致老化HSCs的极性丧失、再生能力降低和分化偏移，已被认为是HSCs衰老的另一个重要分子机制[15]。

3 Wnt3a与Wnt5a转换对HSCs衰老的调控

经典Wnt3a/β-catenin信号通路激活在促进HSCs增殖、保持HSCs免疫表型、正常血细胞谱系分化和自我更新能力及改善机体造血功能重建中发挥着重要作用。衰老的HSCs不但向T 系淋巴细胞分化的能力显著降低，Wnt/β-catenin表达量也明显低于年轻的HSCs[13,16- 17]，且年轻的HSCs中经典Wnt3a信号通路激活后，微管蛋白均匀地分布至胞膜，β-catenin主要分布于细胞核，而衰老的HSCs极性发生改变，微管蛋白在细胞膜分布十分不均，β-catenin则由细胞核转向胞质，低水平的β-catenin活化启动HSCs的自我更新，较高水平的β-catenin活化则驱动HSCs的分化。氧化应激、氧化低密度脂蛋白和氯化锂经DNA损伤所诱发的HSCs衰老与Wnt/β-catenin信号通路激活密切相关。进一步研究证明当归多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)和人参皂苷Rg1(ginsenoside，Rg1)拮抗ox-LDL等所引起的HSCs衰老，APS通过抑制氧化应激损伤、调节细胞周期调控基因表达、抑制端粒 DNA损伤及提高端粒酶活性的途径延缓HSCs衰老，ASP拮抗D-半乳糖所致的小鼠Sca-1+造血干祖细胞衰老的作用机制与抑制Wnt/β-catenin 信号通路激活，下调p53/p21和p16INK4/Rb通路有关[18]。Rg1具则通过调控 Wnt/β-catenin信号通路及其下游的p53/p21信号分子，而发挥抗氧化应激作用，并减轻DNA损伤及延缓Sca- 1+造血干祖细胞衰老[19]。尽管已发现高水平的miR- 146a- 5p可直接作用于靶基因Wnt5a和Wnt1，使2个基因表达下调，经抑制β-catenin、NFAT5和激活GSK- 3β，而抑制肝星状细胞的活化和增殖，发挥抗肝纤维化作用，但是对HSCs中直接影响Wnt信号的上游分子的了解还十分有限[20]。

经典向非经典Wnt信号途径的转换对导致年龄相关或无关的HSCs衰老及机体造血免疫功能失调中有重要意义。检测发现，中年(10 m)与老年(20～24 m)小鼠长期造血的HSCs (Lin-Sca- 1+，c-Kit+，CD34+， Flk2-) 和Lin-细胞高表达Wnt5a和Wnt4，而年轻小鼠的这些细胞则基本不表达Wnt5a，衰老的HSCs中经典Wnt通路中Wnt3a、Wnt1、Wnt5b和Wnt10b蛋白却无明显变化[21]。采用Wnt5a处理年轻小鼠的HSCs，表现出极性HSCs比例减少，自我更新增加，粒系细胞分化能力降低，而髓系细胞分化增强等HSCs 衰老特征，为Wnt5a通路激活后直接抑制HSCs中经典Wnt3a信号传导及降低β-catenin和Axin2水平所致[22]，蛋白酶体抑制剂MG- 132可明显消除Wnt5a所致的β-catenin水平的降低，恢复HSCs的极性与功能特征。Wnt5a驱动的非经典信号途径激活还可经小Rho GTP酶-Cdc42而改变细胞的静止状态，引起HSCs极性消失，导致HSCs 衰老，但选择性Cdc42 活化的抑制剂casin可阻断Wnt5a的这一效应，使衰老的HSCs变年轻[4,23]。与过表达Wnt3a的 HSCs移植到放射性损伤小鼠的结果相反，过表达Wnt5a的HSCs移植后，小鼠骨髓和脾脏中髓系细胞生成增高，而淋系细胞明显减少[24]。与Wnt5a+/+衰老小鼠不同，衰老的Wnt5a+/-小鼠与年轻Wnt5a+/+和Wnt5a+/-小鼠一样拥有相当数量的有极性HSCs，白细胞总数、B细胞和淋巴细胞、红细胞数量都较高，而粒细胞较少。shRNA沉默Wnt5a的老年小鼠HSCs移植实验也证明了与Wnt5a+/-小鼠相似的极性HSCs频率和血象变化[22]。

此外，组蛋白去乙酰酶SIRT家族中的SIRT1可经FOXO3介导抗氧化应激，正性调节HSCs的干性，保持Oct4、Nanog和Fgf5等干性基因表达，保持自我更新及其分化能力，维持HSCs池的稳定。而SIRT6可通过与转录因子LEF1及去乙酰基组蛋白3相互作用，抑制Wnt信号下游靶基因转录，维持HSCs干性，产生与SIRT1相似的HSCs稳态调节作用。SIRT6缺失则通过Wnt信号传导的异常激活，促进HSCs增殖，及在HSCs连续性移植中表现出自我更新能力的显著降低[25- 26]，SIRT2可负性调节GSK- 3β的表达，Wnt5a则能够以不依赖GSK- 3β的方式，通过Siah2和APC降解β-catenin，从而降低经典Wnt/β-catenin信号途径的作用。

然而不可忽视的是，在Lin-HSCs与支持造血的基质细胞的非接触性共培养中，在骨髓基质细胞、尿生殖嵴或胚胎干细胞加入Wnt5a，可明显促进HSCs自我更新和增殖能力的维持，而加入Wnt5a抗体则出现HSCs功能的抑制，也就是Wnt5a信号分子激活所致基质细胞分泌的蛋白分子，在HSCs功能维持中起着重要作用。且Wnt5a+/-小鼠骨髓造血微环境中存在造血壁龛(niche)的缺陷，在此壁龛中更新的HSCs移植后，F-actin功能受抑，不能形成有极性的HSCs，从而严重影响HSCs的黏附、迁移和归巢[27]，极大地影响移植成功率。

4 展望

尽管HSCs衰老的机制尚未完全阐明，但在不断探讨HSCs等成体干细胞衰老发生机制的同时，人们也正在积极研究抗衰老的干预措施。在造血生态壁龛中，通过适当降低HSCs内衰老相关分子Wnt5a 蛋白表达水平或改变通路中Cdc42等其他分子的活性，或提高经典Wnt信号途径功能，都可能使衰老的 HSCs 恢复青春，保持活力，该策略可能为解决 HSCs 衰老及其衰老相关疾病的发生提供新思路。

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