细胞外基质在肺纤维化中作用的研究进展

刘成城，曾林祥

(南昌大学第二附属医院 呼吸内科， 江西 南昌 330006)

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是多种肺部疾病的共同结局，其特征是的成纤维细胞(fibroblast，FB)增殖活化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，导致正常肺泡结构破坏和肺功能持续下降，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是PF最常见的表现形式。肺纤维化是一种慢性进展的高病死率疾病，且目前缺乏有力的治疗手段。过去一直认为ECM是一种惰性支撑结构，并不参与PF的病理发展。而近来越来越多的证据表明，ECM在PF病程中的作用要比传统所认为要复杂的多。本综述将重点讨论ECM的病理改变在PF发展中的重要作用，为研究PF的慢性长期和进行性加重特性提供了新思路并寻求新的可能的治疗靶点。

1 PF中ECM的来源

肌成纤维细胞(myofibroblast，MF/FB)是一类活化了的FB，其增殖活跃并能够分泌ECM蛋白，是ECM的主要来源。而PF中MF主要有3个来源: 原位肺织内FB的转化，气道上皮细胞的上皮-间质转换(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)，以及骨髓起源的循环内纤维细胞(fibrocytes)的转化[1]。FB活化是MF的主要来源，局部肺组织损伤时FB可分化为MF并分泌大量ECM。而EMT是指上皮细胞丧失自身部分细胞特征而向间质细胞发生转化并获得一些间质细胞特征。IPF患者和PF模型中均能观察到肺泡上皮细胞通过EMT转化为FB/MF，多种microRNAs(miRNAs)介导这一过程[2]。Fibrocytes是骨髓起源的循环内的FB前体细胞，其细胞表面兼可表达单核细胞、造血细胞、成纤维细胞系的3种细胞标记。病理情况下fibrocytes能从循环中趋集到局部损伤部位并分化为MF分泌ECM[3]。MF分泌ECM在肺损伤修复过程中是不可缺少的，正常情况下损伤修复活跃期结束时MF会通过细胞凋亡逐渐降解。但肺处于长期慢性损伤或IPF等病理情况下，MF持续存在并引起ECM过度沉积，ECM发生病理性改变最终发展为肺纤维化。

2 PF中ECM的生物力学特性

各种ECM蛋白的过度沉积使其生物力学特性发生改变，其改变通过影响转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)活化推动PF发展。交联酶同样可以调节ECM生物力学特性参与到PF进程，抑制交联酶活性可以影响PF的发展，间接提示ECM生物力学特性的改变在PF进展中起重要作用。

2.1 ECM生物力学特性改变

通过蛋白组学检测发现IPF患者各ECM蛋白组分发生广泛改变[4]，各种ECM蛋白分子的含量和比例是ECM的硬度的决定因素，ECM的硬度与组织的生物力学特性直接相关，PF中ECM硬度不断增加，人肺实质正常的硬度为0.44～0.75 kPa，而PF组织的硬度达到了50 kPa[4]。ECM的过度沉积导致ECM的生物力学特性改变。

2.2 ECM生物力学特性改变促进TGF-β的活化

TGF-β是PF发展中的关键因子，PF中ECM生物力学特性的改变，形成了一个促进TGF-β活化的微环境。ECM充当了TGF-β储存器的作用，大量TGF-β以无活性隐性复合前体形式通螯合在ECM之中。整合素αv在TGF-β1的活化过程中起重要作用，其能够结合TGF-β1隐性相关肽(latent-associated peptide，LAP)中精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)序列并通过TGF-β1结合蛋白链接ECM。这种链接实现了ECM与TGF-β1隐性复合体之间的力传导，ECM力学特性的信息能够通过这种力传导调节TGF-β1的活化[5]。PF中ECM硬度增加使TGF-β隐性复合体发生机械力依赖性构象变化，促使预先存储在ECM中的隐性复合物前体释放出活性TGF-β[6]。而应用整合素αvβ1抑制剂可以阻断ECM生物力学信息的传递从而减弱博莱霉素诱导的PF[7]。因此，ECM的生物力学特性改变可以通过力传导来促进TGF-β的活化而在PF发展中扮演重要作用，而破坏这种力传导是潜在的治疗靶点。

2.3 交联酶调节ECM的生物力学特性

PF病理过程中胶原蛋白可以通过交联各ECM蛋白并指导ECM内的结构构成，同样影响ECM的生物力学特性使其硬度和稳定性增强。在这种胶原交联结构内，ECM分子对蛋白水解酶抵抗能力增强，并加强了细胞与基质之间的相互作用。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidases，LOX)和转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TG)是ECM中主要两个调节胶原交联的酶，血清赖氨酰氧化酶样蛋白2(serum lysyl oxidase-like，sLOXL2)主要由FB合成和分泌。IPF患者sLOXL2明显升高，且其升高水平与疾病进展的风险相关[8]。鼠模型中应用抗LOXL2单克隆抗体可以抑制并逆转博莱霉素诱导的PF，但最新的临床实验中LOXL2人源化单克隆抗体并未得到满意疗效[9]，故LOXL2在PF中的作用还需更深的研究。Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶(TG2)通过在谷氨酰胺和赖氨酸侧链之间形成异构肽来促进ECM蛋白之间的交联，从而影响ECM的结构和稳定性。TG2抑制剂的应用及TG2敲除小鼠都表现出明显的抗纤维化反应[10]。这些研究表明交联酶在PF发展中的重要作用并间接说明了ECM的生物力学特性改变对纤维化进程的影响，而交联酶可以作为肺纤维化治疗的潜在靶点。

3 ECM的纤维化改变影响ECM的来源

PF中ECM的生物特性的改变同样可以影响ECM的3个来源，使纤维化的ECM不再需要进一步的原始促发因素而能够独立推动PF的发生发展。

3.1 FB的分化

IPF患者肺组织ECM内FB具有独特的增殖和分泌特性。FB向MF分化的特征之一就是α-SMA基因表达的增加，在IPF患者肺组织的ECM上培养正常肺组织来源的FB可以使其α-SMA的表达增加[4]，提示纤维化的ECM能够诱导FB的分化。肺ECM纤维化改变与FB的活化之间似乎形成一个正反馈回路，而miR- 29下调在这一过程中起关键作用[11]。一些ECM蛋白可能参与到促FB分化机制。纤连蛋白(fibronectin，FN)是ECM的重要组分，其能结合其他ECM蛋白协助形成网状结构。FN的mRNA选择性剪接区域(extra domain A，EDA)发生保留性剪接而产生EDA片段阳性的FN亚单位(EDA+-FN)。PF的ECM内含有高水平的EDA+-FN，其能够通过整合素α4β1介导FB的活化[12]，FB活化后继而上调FN的表达和分泌，并更快的募集FN形成纤维状网状结构进而加速ECM的重塑，这是MF在PF组织内产生并持续存在的可能原因。但在肝纤维化的研究中FN却能够减少LOX的释放而降低TGF-β的生物效能最终起到抗纤维化的作用[13]，因此FN在纤维化中的具体作用机制还有待进一步明确。此外，腓骨蛋白(fibulin)可以增加FB线粒体的活动并促进其增殖、黏附和分化[14],而骨膜蛋白同样有促FB分化作用[15]。这些ECM蛋白在PF进程中对于FB活化可能起重要作用。

3.2 EMT

ECM改变同样可以影响EMT。特定的ECM成分构成培养肺泡上皮细胞可以观察到EMT，PF的ECM成分构成改变且硬度增加，而硬度不同的培养基上TGF-β所表现的功能反应不同，低硬度的基质能增强TGF-β所介导的细胞凋亡，而高硬度的基质上的TGF-β则诱导EMT反应，而这是通过介导磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路通路实现的[16]。应用FN内潜在TGF-β复合体结合域的单克隆抗体或缺乏该结合域的FN突变体来阻断ECM与潜在TGF-β的力传导能够抑制局部TGF-β驱动的EMT[17]，间接提示ECM力学特性改变对于EMT的影响。此外，ECM的拓扑结构限制同样可以通过增加细胞支架的极性而独立诱导EMT[18]。而作为纤维化发展中调节ECM内部结构构成的交联酶，LOX和TG对EMT同样具有促进作用，阻断LOX甚至会出现与EMT完全相反的间质向上皮转换(mesenchymal-to-epithelial transition，MET)[19]，间接提示肺ECM生物学特性对于EMT的影响。

3.3 Fibrocytes的趋集分化

在PF等慢性炎性反应疾病中，ECM的改变可以通过免疫调节来诱导循环内fibrocytes的趋化迁移，肺纤维化的ECM通过netrin-1介导fibrocytes的趋化聚集，而敲除netrin- 1能够减弱博来霉素的促纤维化作用[14]，这是肺纤维化的可能治疗靶点。Fibrocytes来源于单核细胞谱，体外实验中单核细胞可以自主分化为fibrocytes，而正常肺组织内仅能检测到单核巨噬细胞，fibrocytes却几乎检测不到。这是因为正常组织中FB通过分泌 slit2来抑制单核细胞向fibrocytes的分化从而抑制纤维化[20]。而PF纤维灶中的slit2水平明显降低，纤维化ECM微环境中FB不再分泌slit2，转而分泌骨膜蛋白并介导整合素β1来诱导fibrocytes向MF的分化[15]。这些研究表明PF的ECM微环境改变能够影响fibrocytes的迁移、分化并参与PF发展。

4 ECM相关蛋白在PF发展中的作用

近来发现了几种基质相关的蛋白在PF发展中起重要作用，包括前述的骨膜蛋白和纤连蛋白。而腓骨蛋白- 1(fibulin- 1)，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)也进一步阐明了ECM促纤维化的可能机制。

4.1 Fibulin- 1

Fibulin- 1是FB分泌的一种ECM蛋白，其可以协同其他ECM蛋白促进ECM功能[4]。IPF患者来源的FB相对于正常来源的FB能够分泌更多的fibulin- 1，而IPF患者肺组织内的fibulin- 1水平显著增高且与肺功能呈负相关[21]，提示fibulin- 1是PF病程进展的可能生物指标，且可能成为PF治疗新靶点。Fibulin- 1C(Fbln1c)是fibulin- 1四个亚型之一。Fbln1c基因敲除小鼠在PF模型中气道重塑反应减弱，这是因为Fbln1c基因敲除后胶原的交联障碍并阻断了各种ECM蛋白之间的相互作用[22]。Fibulin- 1C的7个片段序列中，FBLN1C1片段能够使FB细胞的黏附增加，增强FB内的线粒体活动并促进FB的增殖，使ECM蛋白的沉积增加[14]，进一步阐明了fibulin- 1在促PF发展的可能作用机制并提供了新的可能治疗靶点。

4.2 OPN

肺内OPN是一种主要由肺泡巨噬细胞分泌的ECM蛋白，但在PF中细胞应激可以通过细胞外信号调节激酶通路来诱导肺泡II型上皮细胞OPN分泌的增加。OPN与多种器官的炎性反应和纤维化作用相关，其能够影响细胞与ECM之间相互作用，并调节TGF-β1和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表达[23]。IPF患者和PF模型肺内OPN水平都显著增加，其通过调节能够分泌白介素- 17/干扰素-γ的T细胞比率在PF中起重要作用[24]。二氧化硅诱导的PF敏感性存在的性别差异并且这种差异与OPN水平相关[25]，由此可能解释PF患病率和生存率的性别差异问题。

5 问题与展望

综上所述，PF病理性ECM微环境改变能够驱动异常细胞行为，例如细胞增殖、迁移、分化、EMT以及各种分泌型介质的产生和激活从而而在PF的发展中起重要推动作用。ECM在PF中的促纤维化作用研究取得了一定进展，但其作用机制还需进一步明确。迄今少有治疗是针对纤维化ECM的，虽然我们了解各种细胞通过改变ECM蛋白成分结构影响其生物学特性，但具体的信号通路尚不明确，并且各种ECM蛋白在特定生物学特性所起的作用还有待进一步区分。而正常的ECM调节机制又是如何在纤维重塑中失衡还有待深入，这些对于调控ECM微环境以期作为PF的治疗靶点至关重要，也是今后研究的重要方向。

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