胰蛋白酶抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展*

郑文骏，毛智翔，黄琳娟 综述，姚 军，钱翠娟 审校

(台州学院医学院：1.临床医学系；2.医学检验教研室；3.临床医学教研室，浙江台州 318000)

胰蛋白酶是胰腺分泌后活化的一种酶，可以选择性地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，进而分解为氨基酸。科学家们在豆类、谷类、油料作物等植物中发现了多种胰蛋白酶抑制剂。其中，植物来源的胰蛋白酶抑制剂具有相对分子质量较小、免疫反应较弱、原料来源广及价格低廉等优点，受到研究者的关注。目前，临床上胰蛋白酶抑制剂已用于治疗急性胰腺炎、防治脑缺血和脑水肿、抑制宫缩及预防早产等，并且取得了很好的效果[1]。已有的体外研究结果表明，存在于豆类植物中的Bowman-Birk型(BBI)和Kunitz型(KTI)胰蛋白酶抑制剂能够通过抑制癌细胞增殖、黏附、迁移与侵袭，或促进癌细胞凋亡等方式抑制肿瘤细胞的生长，最终抑制肿瘤的发生和发展。此外，胰蛋白酶抑制剂可以与多西他塞、多西紫杉醇、环磷酰胺等多种抗癌药物联合使用，通过增强化疗药物的疗效或者减少化疗药物的耐药，取得更优的抗肿瘤效果[2]。但是，胰蛋白酶抑制剂仍尚未应用于临床肿瘤的治疗。因此，在肿瘤的分子靶向治疗的研究中，胰蛋白酶抑制剂一直是目前研究的热点。

1 胰蛋白酶抑制剂的基本特征

胰蛋白酶抑制剂是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体、动物和植物中都有分布，主要功能是抑制胰蛋白酶的分泌[1-2]。多数已开发的胰蛋白酶抑制剂来源于人和动物，如从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂、从牛肺或牛胰中提取的抑肽酶等。但是，这类胰蛋白酶抑制剂易受到病原微生物(如病毒等)的污染，且相对分子质量较大，可引起过敏反应等。另一些植物来源的胰蛋白酶抑制剂在自然界的含量丰富，活性明确，且相对分子质量较小，所以受到越来越多科研工作者的青睐，如从黄豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂、从南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制剂等[1-2]。根据结构和性质的不同，通常将来源于豆类中的胰蛋白酶抑制剂分为两大类，即KTI和BBI[3]。

1.1KTI KTI是在1945年首次从大豆中分离结晶出来而命名的[3]，它是一种单体蛋白质，相对分子质量在20 kDa左右，由181个氨基酸和2对二硫键组成，同时具有由几个半胱氨酸残基形成的1对或2对分子内二硫键所保持的高度保守的N-末端区域和结构，呈易变的非螺旋形，对热不稳定[4]。分子内只有1个活性中心，其活性中心位于第63号的精氨酸和第64号的异亮氨酸上，主要对胰蛋白酶直接地、专一地起作用[5]。KTI属单头抑制剂，即一个抑制剂分子只结合一分子胰蛋白酶。

1.2BBI BBI是由Bowman在1944年作为丙酮不溶因子从大豆中分离出来的，Birk又于1961年成功纯化并定义BBI；BBI也是一种单体蛋白质，相对分子质量在8 kDa左右，是由71个氨基酸组成的单肽链，含有7个二硫键和大量的半胱氨酸，具有热稳定性[6]。2个BBI结构域由保守的二硫键保持，每个结构域携带一个活性位点，在2个不同活性位点上具有2个独立的结合中心，即胰蛋白酶结合中心(第16号的赖氨酸，第17号的丝氨酸)和胰凝乳蛋白酶结合中心(第44号的亮氨酸，第45号的丝氨酸)，分别用于抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[7]。

2 胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用

胰蛋白酶抑制剂在肿瘤中的研究仍集中在体外研究中，尚未见到胰蛋白酶抑制剂应用于人体内肿瘤的治疗的报道。目前的体外研究表明，胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用主要通过调控细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、或抑制肿瘤细胞侵袭等实现的[6]。

2.1胰蛋白酶抑制剂的抗细胞增殖作用 现有的研究结果表明，胰蛋白酶抑制剂能够抑制多种肿瘤细胞如人结肠癌细胞、人白血病细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞、舌癌细胞的生长和增殖[8-13]。

有研究者最早在番薯根中发现并提取出胰蛋白酶抑制剂[14]。研究发现，胰蛋白酶抑制剂能诱导人早幼粒白血病细胞NB4出现细胞周期阻滞，从而抑制细胞的增殖[9]。其中一种在番薯根中提取的主要储存蛋白被命名为Sporamin，Sporamin占番薯根中总蛋白的80%，属于KTI[15]。有研究表明，Sporamin能够通过抑制Akt/GSK-3信号通路的转导从而抑制体外培养的人舌癌细胞的生长和增殖，并且这种作用具有一定的浓度依赖和时间依赖性[16]。而且，Sporamin也能够抑制体外培养的胰腺癌细胞的生长和增殖，这种作用可能与Notch4蛋白的表达下调有关[16]。

另一种类型的胰蛋白酶抑制剂BBI能够通过上调肿瘤抑制因子-连接蛋白43(Cx43)的表达而抑制骨肉瘤细胞的增殖[17]。此外，BBI通过下调细胞周期蛋白D1、E1和ERK1/2的磷酸化及上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达诱导人乳腺癌细胞MCF-7在G1/S期出现细胞周期停滞，且这可能与BBI对泛素-蛋白酶体机制的抑制有关[11]。另一种从豇豆种子里纯化而来的黑眼豌豆胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂(BTCI)则是通过抑制VEGF分泌来抑制胃癌AGS细胞及结肠癌HT-29细胞增殖[18]。

2.2胰蛋白酶抑制剂的促凋亡作用 胰蛋白酶抑制剂在细胞凋亡方面也发挥了显著的作用，目前已发现，不同的胰蛋白酶抑制剂分别对肝癌细胞、人白血病细胞、乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人肺癌细胞等发挥促凋亡作用，其中诱导细胞凋亡最主要的途径就是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的级联反应[19-23]。

一种来源于荞麦并经过重组的胰蛋白酶抑制剂rBTI能通过促进线粒体中细胞色素C的释放诱导肝癌细胞H22的凋亡，同时对正常的7702细胞仅有很小的作用[19]。紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂通过Fas与其配体结合反应激活Caspase-8，产生一系列级联反应导致细胞的凋亡[9]。BTCI能引起线粒体膜透化、溶酶体膜透化和DNA断裂导致乳腺癌细胞的凋亡[11]。

胰蛋白酶抑制剂还能通过影响转录因子来促进癌细胞的凋亡。在结肠癌细胞中存在一种过表达的高度保守的核蛋白高迁移率族蛋白1(HMGB1)，经研究发现这种蛋白与结肠癌的进展关系密切[24]。尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁能抑制HMGB1的表达，同时增加NF-κB活性导致其靶基因产物c-IAP2的过表达来达到促进细胞凋亡的作用[22]，同时还能抑制Caspase-9和Caspase-3的活性[25]。另外一种新型经苦瓜提取的生物活性肽BG-4表现出显著的胰蛋白酶抑制作用，研究发现，BG-4能通过上调Bax蛋白的表达并下调X连锁凋亡抑制蛋白的表达，从而促进结肠癌细胞的凋亡[26]。

2.3胰蛋白酶抑制剂的抗侵袭作用 肿瘤的侵袭能力主要体现在细胞外基质的降解、血管淋巴管的生成、上皮细胞-间充质转化等方面，而胰蛋白酶抑制剂能通过影响这些过程来达到抗侵袭的作用。

Bikunin也是一种KTI。一方面，Bikunin能通过抑制胞外钙离子内流，来抑制转化生长因子(TGF)-β1介导的ERK信号转导及Src酪氨酸激酶的活化，从而导致HRA细胞中PA系统的抑制[27]。另一方面，妊娠相关血浆蛋白-A基因与MT-SP1基因可能分别作为Bikunin处理后的早期反应基因与晚期反应基因，而二者都与癌细胞的侵袭相关[28]。此外，BBI能通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌和活性，来阻碍癌细胞的侵袭和转移，同时可以明显地降低VEGF的产生和分泌，从而抑制肿瘤的血管生成[18]。

胰蛋白酶抑制剂EcTI则是通过抑制胃癌细胞整合素-β1的表达，造成了Src-FAK通路受阻，进而阻止Cortactin上主要的Src磷酸化位点发生酪氨酸磷酸化，使细胞伪足无法形成，抑制细胞的黏和侵袭作用[29]。此外，EcTI可通过抑制MMP-9、MMP-12、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)等抑制肿瘤细胞侵袭作用[30]。

3 胰蛋白酶抑制剂的应用

乌司他丁现与多种抗癌药合用，来增强其药效。乌司他丁与多西他塞通过抑制血管生成和上皮间质转化(EMT)，从而抑制乳腺癌的侵袭和转移，二者具有协同作用[31]。此外，有研究表明,乌司他丁和环磷酰胺处理小鼠异种移植乳腺癌细胞MCF-7，两者都能有效抑制癌细胞中CXCR4和MMP-9的表达，且二者具有协同作用[16]。同时乌司他丁也能增强多西紫杉醇的抗癌作用[5]，不过乌司他丁增强多西紫杉醇的抗癌作用的机制还不清楚。

除了与其他抗癌药物合用之外，还可以通过胰蛋白酶抑制剂与功能型多肽重组来进行抗肿瘤治疗。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是一种在癌细胞的细胞膜上表达，且在正常细胞不表达的蛋白质[32]。因此，通过GRP78来行抗肿瘤治疗是可行的。而绿豆胰蛋白酶抑制剂(mTI)是一种经绿豆提取的胰蛋白酶抑制剂，研究表明，通过GRP78的结合肽WIFPWIQL与mTI的融合形成重组蛋白GBP-TI，GBP-TI能通过GBP与GRP78的结合显著提高其入胞的能力，再通过mTI的抗癌作用对结肠癌细胞产生特异且强大的生长抑制和凋亡诱导作用，该重组过程不影响二者酶活性，且能显著增强其抗癌作用[33]。

4 小 结

在不同的肿瘤中胰蛋白酶抑制剂具有不同的表达趋势，目前胰蛋白酶抑制剂在肿瘤细胞中的效应还未完全明确，其在肿瘤中发挥的作用机制还需要更深入的研究。同时，对胰蛋白酶抑制剂的研究还只停留在细胞、动物试验的层面，胰蛋白酶抑制剂在早期癌症临床治疗、联合用药及预后等方面的作用也需要更深入的研究。