APOA4/C3基因簇及APOB基因多态性与新疆哈萨克族血脂异常的关系

张伟 ，马晓磊 ，张凌云 ，周婷 ，蒋松柏 ，廖新慧 ，王岳 ，吴静 ，黄刚 *

（1石河子大学第一附属医院，新疆 石河子 832002；2石家庄市第一医院，河北 石家庄 050000；3博州温泉县人民医院，新疆博乐 833500；4塔城市人民医院，额敏 塔城 834700；5沙湾县人民医院，新疆 石河子 832100）

心血管疾病（Cardiovascular disease，CHD）是当今导致发达国家和包括中国在内的一些发展中国家人口死亡的首要原因[1]。经过几十年的研究，已经明确了一些心血管疾病的危险因素。其中，以血浆甘油三酯（Triglycerides，TG）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）水平升高，和（或）高密度脂蛋白胆固醇（High-density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）水平减少为特征的血脂异常，约占人群归因危险度的50%，被证实为CHD的独立危险因素[2]。

然而，目前原发性血脂异常的发病机制不明确，可能涉及环境因素、遗传因素及环境因素与遗传因素交互作用的结果[3]。

由于全基因组关联分析（Genome-wide Association Study，GWAS）研究表明基因多态性与血脂异常密切相关[4]。近年来人们对影响血脂或脂蛋白水平的染色体区域和特异基因进行了大量的研究[5]，其候选基因的研究主要集中在载脂蛋白基因，血管紧张素受体基因，细胞因子基因，脂蛋白受体基因，基质金属蛋白酶基因等，其中载脂蛋白基因是研究的热点之一。但研究间存在争议，形成争议的原因考虑与种族因素有关[6-8]。

哈萨克族有着独特的饮食及生活习惯，为了排除生活习惯的影响，本研究选择了哈萨克族人群聚集的地区作为研究对象，运用病例对照研究，探讨APOA4/C3基因簇及APOB基因多态性与血脂异常的相关性，以期为哈萨克族血脂异常预防和治疗提供新的证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

石河子大学医学院第一附属医院、沙湾县人民医院、温泉县人民医院及塔城市人民医院体检的哈萨克族患者，此研究获得了石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.1.1 纳入与排除标准

入选标准：参照2007年《中国成人血脂异常防治指南》[9]血脂异常组：空腹 TG≥2.26mmol/L，TC≥6.22mmol/L，LDL-C ≥4.14mmol/L，HDL-C<1.04mmol/L，有一项或一项以上可诊断血脂异常。对照组：TG<1.7 mmol/L，TC<5.18 mmol/L，LDL-C<3.37 mmol/L，HDL-C≥1.04 mmol/L。

排除标准：肾病综合征、甲状腺功能减退症、肾功能衰竭、肝脏疾病、系统性红斑狼疮、糖原累积症、骨髓瘤、脂肪萎缩症、急性卟啉病、多囊卵巢综合征等可能影响血脂代谢的疾病和药物如糖皮质激素及调脂药物者等。

1.2 研究方法

1.2.1 资料的收集

康师傅控股有限公司执行长韦俊贤在采访中诚挚地说：“康师傅本身就是改革开放的成果，也是改革开放的见证者、亲历者和受益者。没有改革开放，就没有康师傅。”

采用统一调查表由专业人员询问并记录一般情况，包括姓名、性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族史等。测量身高、体重，身高精确到厘米，体重精确到百克，体重指数 = 体重（kg）/[身高(m)]2。

1.2.2 生化分析

空腹12 h后收集外周静脉血样 5 ml，使用Olympus2700自动生化分析仪进行血脂等生化指标检测。

1.2.3 DNA提取及SNP分型

DNA提取：采用血液基因组DNA快速提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取标本全血基因组DNA，用分光光度仪分别于260 nm和280 nm波长处检测吸光度，计算DNA浓度，并用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

引物及探针的合成：通过PubMed数据库确定研究基因的SNPs序列号，应用AssayDesigner3.0软件进行引物及LDR探针设计，每个SNP的引物均包括一对扩增引物和一条延伸引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1，LDR探针序列见表2。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

表2 LDR探针序列Tab.2 Sequence of LDR probe

多重 PCR(polymerase chain reaction，PCR)：反 应体系 15 μL：1 μL模 板 DNA，1.5ulBuffer，1.5 μL MgCl2，0.3 μL DNTP，1.5 μL引物混合液，0.3 μLTaqDNA聚合酶，加双蒸水补足。反应条件：94℃预变性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃ 90 s，35个循环；最后 72℃延伸3 min。

多重 LDR：反应体系 10 μL，1 μL Buffer，0.1 μL探针混合液，0.125 μL DNA连接酶，3 μL PCR产物，加双蒸水补足10 μL。反应条件：94℃30 s，56 ℃3 min，进行 30个循环。

测序及基因分型：取 1 μL延伸产物，加 8 μL上样缓冲液，95℃变性3 min，立即冰水浴，采用ABI 3130XL测序仪测序，判读各样本各位点上的基因型，由上海捷瑞生物技术有限公司完成。

1.3 统计分析

运用Hardy-Weinbreg平衡检测研究对象是否具有人群代表性。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。计数资料以率和构成比表示。基因型、等位基因频率比较采用2检验或单因素Logistic回归分析。数据分析采用SPSS22.0统计软件。采用SHEsis软件进行单体型分析。 <0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般资料

511例纳入研究，两组间性别、年龄、体重指数（Body Mass Index，BMI）、吸烟、饮酒、是否患高血压及糖尿病对比没有显著差异（ 均>0.05），两组间TG、TC、LDL-C、HDL-C对比，差异均有显著差异（均 <0.01）（表 3）。

表3 血脂异常组和血脂正常组一般资料比较Tab.3 Comparisons of common items

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

Hardy-Weinberg遗传平衡定律是群体遗传学基本法则之一，用以判断所研究群体是否是遗传平衡的。本研究分别对4个SNPs位点在血脂异常组和对照组中的基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验，4个 SNPs位点均符合 Hardy-Weinberg平衡（ 均＞0.05），提示我们研究人群已达到遗传平衡（表4）。

表4 各snp位点的Hardy-Weinberg平衡检验Tab.4 Hardy-Weinberg’s equilibrium test

2.3 四个位点测序结果图

测序结果经过Chromas Version 2.3软件处理后各个位点电泳峰型图（图 1、图2）。

图1 Chromas Version 2.3软件读取rs5104，rs734104位点峰图Fig.1 Electrophoresis peak figures of rs5104，rs734104 were read by Chromas Version 2.3 software

图2 Chromas Version 2.3软件读取rs5128，rs693位点峰图Fig.2 Electrophoresis peak figures of rs5128，rs693 were read by Chromas Version 2.3 software

2.4 血脂异常组及对照组SNPs位点基因型及等位基因频率比较

血脂异常组及对照组SNPs位点基因型及等位基因频率比较见表5。

表5 两组SNPs位点基因型和等位基因频率对比Tab.5 Comparisons of genotypes and allele distributions

表5 续

2.5 各SNP位点与血脂异常的风险分析

APOA4 rs5104 AG、GG或 AG+GG基因型携带者患血脂异常的风险分别是AA基因型携带者的1.727、2.220、1.808倍，G等位基因携带者的血脂异常的风险是A等位基因的1.594倍；APOC3 rs734104 CT或CT+CC基因型携带者患血脂异常的风险分别是TT基因型携带者的1.574、1.621倍，C等位基因携带者的血脂异常的风险是T等位基因的 1.457倍。APOC3 rs5128 CG、CC或 CG+CC基因型携带者患血脂异常的风险分别是GG基因型携带者的 1.917、2.135、1.959倍，C等位基因携带者的血脂异常的风险是G等位基因的1.680倍；APOB rs693 CT或CT+TT基因型携带者患血脂异常的风险分别是CC基因型携带者的0.408、0.399倍，T等位基因携带者的血脂异常的风险是C等位基因的0.443倍（表 6）。

表6 各个SNP位点基因型及等位基因分布与血脂异常的风险分析Tab.6 Relationship between the four loci and dyslipidemia

2.6 各个单体型与血脂异常相关性

本研究通过SHEsis软件对四个SNP位点进行单体型分析，共得到7种单体型（表7）。ATGT患血脂异常的风险降低，<0.05。GCCC患血脂异常的风险升高，差异有统计学意义（ <0.05）。

表7 血脂异常组及对照组4个SNPs单体型分析Tab.7 Haplotype analysis of the four loci in the two groups

3 讨论

血脂水平与心血管疾病紧密相关。与2002年相比，中国成人血脂异常人群呈大幅度上升，总体患病率高达40.4%。据统计，人群血清胆固醇的升高，将导致2010~2030年期间我国心血管病事件增加约920万[10]。血脂异常及由它引起的心血管疾病的流行趋势日趋严重，越来越威胁人们的健康，血脂异常人群的预防和控制是当今的迫切任务。降低甘油三酯（TC）、低密度脂蛋白 C（LDL-C）等血脂水平被认为是防治心血管疾病的重要手段，其水平也被视为预测心血管疾病发生风险的有效指标。

近年来，对于血脂异常的发病机制，多数学者从分子遗传学角度进行研究。目前发现一些脂类代谢相关基因是影响机体血脂水平的重要因素，如APOA4/C3基因簇、APOB基因。研究发现APOA4/C3基因簇及APOB基因上的SNPs多态性与血脂异常有关，但是研究结果存在差异。

APOA4基因含3个外显子和2个内含子，全长约2690 bp，编码377个氨基酸。外显子分别长134 bp、127 bp和 1178 bp，内含子分别长 358 bp和776 bp，插入在第17和第59密码子处。目前关于中国人群rs5104多态性的研究鲜见报道；APOC3位于人11号染色体长臂上，全长5.1 kb，由4个外显子和3个内含子组成。在APOC3内部及周围存在多个多态性位点，其中位于3’端非翻译区的rs5128位点与血脂的关系最为密切[11]。而关于中国人群APOC3基因rs734104多态性的研究鲜见报道；APOB基因位于人类第2号染色体短臂上，由28个内含子及29个外显子组成，全长43 kb。rs693位点位于APOB基因的第26号外显子中，虽然发生的是C＞T的同义突变，但该位点与血脂水平密切相关，其原因可能是该位点与APOB基因或者是其他与血脂有关的基因相互关联[12]。

本研究发现 rs5104、rs734104、rs5128 3个位点多态性都与哈萨克族血脂异常相关：rs5104 GG基因型携带者患血脂异常的风险较AA型增加了1.2倍（ ＜0.05）；rs734104 CT+CC基因型携带者患血脂异常的风险较TT型增加了 0.6倍（ ＜0.01）；rs5128CG+CC基因型携带者患血脂异常的风险较GG型增加了 1.0倍（ ＜0.01）。汉族[13]这 3个位点多态性与血脂异常的相关性与哈萨克族相似：rs5104GG基因型携带者患血脂异常的风险较AA型增加了 0.9倍（ ＜0.05）；rs734104 CT+CC基因型携带者患血脂异常的风险较TT型增加了1.0倍（ ＜0.01）；rs5128CG+CC基因型携带者患血脂异常的风险较GG基因型携带者增加了0.7倍（ ＜0.01）。这与Teslovich的观点一致[4]，Teslovich通过GWAS研究认为血脂异常相关位点在不同民族对血脂代谢的影响是相似的。

但是 Chang[6]及 Hubacek[7]等的观点与以上不一致。他们认为不同等位基因的多态性，在各个民族中对血脂的影响不一定一致。这一观点与本研究rs693的结果一致。本研究发现血脂异常哈萨克族?rs693 T等位基因携带者患血脂异常的风险是C等位基因携带者的0.443倍。但是在我们对汉族[13]的研究中没有发现这种情况。一个来自巴西的研究[14]发现rs693 T等位基因频率与低密度脂蛋白胆固醇水平增高密切相关，与本研究以及对汉族[13]的研究结果都不一致。这可能与研究方法、样本量不同有关外，不能排除与种族不同有关。此外，GWAS对稀有碱基不敏感[15]，本研究发现血脂异常哈萨克族rs693的T等位基因频率为9.14%（49/536），虽然不是稀有突变，但是其等位基因频率明显低于其它3个位点，是否与此有关，需要进一步研究。

研究结果不一致的原因还可能与不同多态同时存在时的相互抵消或者加强的作用有关。本研究发现新疆哈萨克族人GCCC单体型携带者容易患血脂异常，ATGT单体型携带者患血脂异常的风险明显较低。

总之，本研究发现哈萨克族血脂异常与这4个位点多态性有关，但是与其它民族的研究结果不一致，这可能主要由于种族不同所引起，但是，也不能完全排除由于样本量、地域、研究方法不同所引起，需要进一步研究。