猪流行性腹泻病毒诊断技术概述

(山西省太谷县畜牧兽医中心 范村镇畜牧兽医站，山西 太谷 030800)

0 引言

猪流行性腹泻病毒(PEDV)，冠状病毒科的冠状病毒属成员，1978年在欧洲被发现[1]。自从在欧洲初步分离以来，PEDV已经扩散到世界上几个主要的养猪产地，包括亚洲和北美洲。1982年该病毒首次在日本被发现，并逐渐蔓延到几个邻近国家，包括韩国、中国、泰国、中国台湾和越南。2013年，PEDV蔓延到北美，在美国最初被发现，随后扩散到加拿大和墨西哥[2]。在美国，PEDV侵入后迅速传播至全国，导致700多万头仔猪死亡(占该国猪群总数的10%)。PEDV是猪流行性腹泻(PED)的致病因子，能够引起急性，高度传染性的严重肠道疾病。所有年龄的动物都对PEDV易感[3]。然而，成年猪通常呈现较轻的症状，死亡率较低，低日龄的仔猪发病最为严重，会表现出严重的腹泻、呕吐，脱水而死，病死率极高。PEDV的严重致病性已对养猪业造成了不容小觑的经济损失，快速、准确的诊断病原尤为重要。

1 病毒分离

Vero细胞是使用最广泛的细胞系，可用于PEDV的分离和增殖[4]。PEDV的自我复制能诱导细胞出现典型的细胞病变效应(CPE)，包括细胞融合，合胞体形成和细胞脱离。细胞培养过程中PEDV的复制取决于细胞培养基中外源性胰蛋白酶[5]。胰蛋白酶的蛋白水解活性导致S糖蛋白分解成为S1和S2亚基，增强病毒的感染性，促进其与细胞融合并在细胞中释放。因此，必须在培养基中加入外源性胰蛋白酶，用于增强细胞培养物PEDV的分离。

2 病毒中和试验(VN)

VN是利用PEDV的特异性抗体结合病毒，阻断病毒的复制周期，诱导病毒颗粒的凝集或裂解，降低PEDV的感染力。目前，基于CPE的VN已经用于PEDV的抗体中和反应的检测。

3 免疫荧光(IF)

免疫荧光(IF)测定已被用于检测细胞培养中的PEDV抗原以确认是否分离成功，或用于肠组织冷冻切片中检测感染肠细胞中的病毒抗原。IF是使用荧光基团偶联的PEDV特异性抗体检测细胞内病毒抗原，在荧光显微镜下进行观察。在感染的各个阶段，包括涉及疾病潜伏期的早期阶段，在整个小肠的绒毛上皮细胞中通过IF都能检测到PEDV抗原。在临床症状出现后，通过IF法在肠样品中能检测到病毒抗原的时间长达72 h。

4 免疫组化(IHC)

IHC是在免疫学(抗原-抗体)和化学标记的基础上标记PEDV特异性抗体，通过化学底物显色对PEDV抗原进行定位检测。IHC可对各种组织和细胞切片进行检测，可对PEDV的感染过程进行定位。石蜡切片是制备组织切片最常用的方法，可长期保存，有利于组织样品的回顾性检测[6]。

5 聚合酶链式反应(PCR)

以PCR技术为基础的检测方法可用于各种病料、样品的检测，相比其他的抗原检测法，本方法的灵敏度更高，特异性更强[7]。传统的RT-PCR主要是通过设计病毒的特异性引物对PEDV基因组的靶区域进行扩增，用琼脂凝胶电泳对扩增产物进行鉴定。实时荧光定量PCR是在传统RT-PCR的基础上进行改良，在反应体系中加入荧光基团，能够进行定量且定性的分析，灵敏度更高[8]。

环介导等温扩增技术(LAMP)是在传统PCR技术基础上进行改良的新型核酸扩增技术，其模板不再需要预变性，可以在等温条件下进行扩增，操作简单，无需特殊仪器，特异性强，检测范围更广[9]。针对PEDV的检测，目前已设计了两种LAMP检测法，分别是对PEDV的M基因和N基因设计4～6对特异性引物，并与传统检测方法如ELISA和RT-PCR进行了比较性试验，试验结果显示，RT-LAMP的成本更低、敏感度更高、特异性更好，具有更广阔的应用前景[10]。

6 酶联免疫吸附试验(ELISA)

目前，间接ELISA和竞争阻断ELISA已用于PEDV的检测。其中，间接ELISA是基于全病毒在细菌中表达的重组病毒蛋白质(S，N和M)。在该方法中，首先将病毒抗原固定在聚苯乙烯表面上，并与待检样品孵育以形成抗体-抗原复合物[11]。通过使用与比色底物偶联的酶联二抗来进行检测。竞争阻断ELISA是基于PEDV的特异性单克隆抗体或多克隆抗体，将抗原与待检样品一起包被于微孔板，与血清中存在的抗体竞争性结合抗原[12]。

ELISA方法虽然操作简单，但也存在一定的局限性，只能检测其是否发生感染过PED，无法确定是否正在发病。

7 荧光微球免疫测定(FMIA)

荧光微球免疫测定(FMIA)是基于流体荧光微球激光扫描系统，其具有优于ELISA的几个优点，包括灵敏度高，更高通量，以及同时检测多种病原体的能力。 FMIA基于将特异性病毒抗原偶联到荧光微球，使用双激光仪器检测抗原-抗体反应，并且结果表示为中值荧光强度(MFI)。

8 胶体金免疫技术(GICT)

GICT是利用胶体金作为指示标记进行免疫标记，是一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下形成稳定状态的金颗粒[13]。此方法与ELISA相似，具备价格低、操作简单、特异性好、快捷等优点，可用于大量临床样品检测，有很好的应用前景。

PEDV快速、准确的检测是对PED进行治疗和预防的首要且最为关键的工作，是重中之重。本文的主旨就是对PEDV的主要检测方法进行概述和分析，各种方法都有自己的优缺点，尤其是在临床检测的过程中，结合实际的发病情况，实验室的条件设施，检测人员的技术水平等多方面的因素，去选择最为合适的检测方法进行检测。如果条件允许的话，最好采用两种以上的方法进行相互印证，提高检测结果的准确性，为临床防控提供更为准确的科学依据，更好地监测PEDV的发生和流行，有效控制和降低PED的暴发和带来的经济损失。

参考文献

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[13] 张利勃, 周铁忠, 王珅,等. 猪流行性腹泻胶体金抗体检测技术的建立及其应用[J]. 中国农学通报, 2011, 27(3):374-377.