诱导多能干细胞在遗传性血液病中的应用与前景

刘 益，胡韦维 综述，张鹏辉 审校

(重庆医科大学附属儿童医院检验科 400014)

异基因造血干细胞移植(HSCT)是目前根治遗传性、恶性血液系统疾病的最重要的手段，然而配型成功率低、易发生急性移植物抗宿主病严重限制了其在临床治疗中的广泛应用。诱导多能干细胞(iPSCs)具有细胞来源广、可直接从患者自身获得、在体外可诱导分化为造血祖细胞的优点。随着基因编辑技术不断发展，靶向修复患者iPSCs从而治疗遗传疾病已成为可能。本文就iPSCs在遗传性血液病中的研究进展作一综述。

1 iPSCs技术

干细胞是指一类具有自我更新能力与多向分化潜能的原始未分化的细胞群体，因其具有多向分化潜能，自其发现以来便备受临床研究、再生医学界的关注，将已分化的体细胞通过重编程技术，使其重回干细胞状态，一直是国内外科学研究热点。目前常用的重编程技术有3种：核移植(NT)、细胞融合、iPSCs技术。iPSCs技术是新近发明的重编程技术，目前广泛应用于细胞治疗、药物筛选、毒理测试和研究疾病机制中。它具有细胞来源广、可直接从患者体细胞中获得的优点，避免了伦理问题和免疫排斥反应。伴随基因编辑技术的快速发展，以用iPSCs为基础，进行基因靶向修饰日趋成熟。

2007年TAKAHASHI等[1]通过逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM因子)4种转录因子导入人成纤维细胞中，获得了一种在形态、增殖能力、表面抗原、端粒酶活性及干细胞相关基因表观遗传状态均与胚胎干细胞相似的细胞，即iPSCs。随着研究不断深入，皮肤成纤维细胞、角质层细胞、小肠上皮细胞、神经肝细胞、外周血单个核细胞、肝细胞、胰腺β细胞等已被证实可重编程为iPSCs；同时Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4种转录因子可以被其他因子如Tet1、Sox3、I-Myc等替代[2-4]。去除高致癌的c-Myc，仅用Oct4、Sox2、Klf4 3种转录因子也可将体细胞诱导为iPSCs[5]。而更安全、便捷的化学小分子介导的体细胞诱导重编程技术也在小鼠内、中、外胚层细胞中取得成功[6-7]。为iPSCs治疗人类疾病奠定了理论基础。

2 iPSCs在遗传性血液病中的应用

遗传性血液病是由遗传因素导致骨髓造血功能紊乱的疾病，造血干细胞移植是目前根治遗传性血液病的重要手段，然而其来源有限、风险极大，临床上常以对症支持治疗为主，大大降低了患者的生存年限和生活质量。iPSCs的出现为遗传性血液病的治疗带来了新思路，下面以范可尼贫血、镰刀型细胞贫血病、地中海贫血为代表，简述iPSCs在遗传性血液病中的应用。

2.1范可尼贫血(FA) FA是一种先天性再生障碍性贫血，属于常染色体隐性遗传病，患者体细胞对DNA交联剂异常敏感，易发生染色体断裂，致骨髓造血功能衰竭，出现全血细胞减少，常伴有先天性骨骼、心脏等畸形。长期以来敲除FA基因的小鼠无法表现出人类骨髓三系下降的表型。2009年RAYA等[8]将包含VAV启动子的失活慢病毒转入FA患者的成纤维细胞中进行基因修复，并把包含OSKM 4种转录因子的逆转录病毒导入修复后的细胞中成功获得了FA-iPSCs，同OP9细胞共培养后得到表型正常的红系和髓系造血祖细胞，FA-iPSCs及分化成红系或髓系造血祖细胞仍保留对DNA交联剂敏感的特点，然而该实验证实iPSCs不能直接从FA患者体细胞诱导获得，必须先将患者体细胞进行修复后方可成功诱导。随后，MUELLER等[9]证明低氧状态下FA患者的体细胞可不经基因修复直接诱导成iPSCs。OSBORN等[10]设计了针对FA基因15号外显子1461C>A的sgRNA，利用CRISPR/Cas9修补患者的iPSCs，并证实该位点同源重组修复(HDR)概率高于非同源重组修复(NHEJ)，保证了基因编辑技术治疗FA的精确性与安全性，为将来应用iPSCs联合基因修复技术治疗该病奠定基础。

2.2镰刀型细胞贫血病(SCD) SCD是由点突变引起β珠蛋白第6位谷氨酸被缬氨酸替代，导致血红蛋白结构异常，该病在世界范围内分布广泛，具有高的致死性和发病率。2007年，HANNA等[11]将来自人源性SCD小鼠成纤维细胞诱导成iPSCs，电转正常β珠蛋白基因至iPSCs后，利用拟胚体(EB)技术将其分化为造血祖细胞，再注入回SCD小鼠中，最终在小鼠体内检测到正常β珠蛋白基因表达。ZOU等[12]将包含了药物筛选位点的loxP序列和锚定突变位点的锌指核酸酶(ZFN)序列的质粒转入SCD患者(βS/βS)来源的iPSCs中，将1条突变的βS修复为正常的βA，得到了基因型为βA/βS的iPSCs，用Cre重组酶将loxP序列敲除并分化为红细胞后，可得到25%～40%的正常βA表达。2016年LI等[13]找到一种更高效、安全的诱导SCD患者iPSCs方法，他们将EB病毒上的oriP/EBNA1区连致HDAd载体内，解决了HDAd载体无法进行重编程的问题，后将包含Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin-28、p53shRNA序列的HDAd/EBV载体导入敲除病毒编码区的腺病毒中，降低了腺病毒的毒性和免疫活性，大幅度提高了诱导效率，利用CRISPR/Cas9技术将针对SCD的sgRNA、Cas9蛋白及HDR单链寡核酸修复模板(ssODN)注入iPS细胞系中，修复效率高达67.9%(βA/[βS+βA])。修复后的iPS细胞行全基因组测序未发现肿瘤抑制基因或其他致病基因改变，这为修复患者来源的iPSCs提供了快速、高效、安全的方法，也为治疗其他基因突变疾病奠定基础。

2.3β-地中海贫血 β-地中海贫血是常见的遗传疾病，由β珠蛋白基因的缺失或突变引起，正常β珠蛋白的减少致使血红蛋白不能携带足够氧气满足机体代谢需要，中间型、重型患者常需终生输血、祛铁治疗。2009年，YE等[14]成功获得了β-地中海贫血患者成纤维细胞来源的iPSCs，同时还将来自β-地中海贫血胎儿产前基因筛查的羊水或绒毛细胞诱导成iPSCs；最近，iPSCs也被证实可由β-地中海贫血患者的外周血或脐带血细胞产生[15]，为日后治疗胎儿重型地中海贫血提供了重要平台。WANG等[16]用同源重组的方法修复了β-地中海贫血患者来源的iPSCs，将修复后的iPSCs定向分化为造血祖细胞并注入免疫缺陷鼠中，成功检测到人正常β珠蛋白表达。MA等[17-18]先后应用转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术和ZFN技术修复了β-地中海贫血患者iPS细胞株上β-珠蛋白的基因突变，修复后的iPSCs仍具有正常核型与多向分化能力，同OP9系统共培养后可向红系分化，应用外显子测序技术检测ZFN修复前、修复后及向造血祖细胞分化时的β-地中海贫血iPSCs发现，基因突变多发生于重编程和基因修复过程中，与iPSCs的传代次数和培养时间无关。随着CRISPR/Cas9技术的发展，iPSCs技术与CRISPR/Cas9技术联合治疗β-地中海贫血相关研究被不断报道，LIU等[19]应用CRISPR/Cas9联合小分子化合物修正β-地贫iPSCs突变的β-珠蛋白基因，在保证修正后细胞保持正常核型与完全多能性的同时，提高了修正效率且无脱靶作用，为应用CRISPR/Cas9联合iPSCs治疗血红蛋白病提供了新方法。XIE等[20]将CRISPR/Cas9与piggyBac技术相结合，在修复β-地贫iPSCs后不残留基因痕迹，为未来应用iPSCs治疗地中海贫血提供了有力依据。

3 展 望

iPSCs技术为治疗血液系统疾病的提供了新的方向，但将其投入临床治疗尚需克服很多难关。首先，分化后的靶细胞移植入体内后其分化方式和分化机制仍有待研究，同时iPSCs也存在着诱导效率低和安全性问题。随着研究的进一步深入，现已发现诱导过程中表达细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白依赖性激酶1、抑癌基因p53、细胞周期调节基因INK4A抑制剂和某些特定的miRNA可提高诱导效率，而与体细胞相比，成体干细胞更易转变为iPS细胞[21-23]。同时，细胞因子载体也由最初的逆转录病毒改为更安全的腺病毒、仙台病毒、质粒等。近年来，降低外源基因随机整合的实验方法也获得了成功，相信随着对重编程过程和表观遗传状态研究的逐步加深，人们可以找到更安全、高效的诱导方法[24]。iPSCs技术与基因编辑技术、基因表达调控技术相结合后将为遗传性血液病的治疗开启新的篇章。