RCAN1在外周血管疾病中作用的研究进展

李 波，谢 锐 综述，张承圣 审校(重庆市巴南区人民医院，重庆 401320)

钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CN)又称蛋白磷酸酶2B(PP2B)，是一种钙调素(Calmodulin，CaM)依赖重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，其在细胞信号传递过程中直接受细胞内 Ca2+浓度的调节。活化的CN通过对下游NFAT、tau、CREB、BAD等底物去磷酸化作用[1]，参与心肌肥大、细胞凋亡、突触的可塑性以及记忆功能等多种信号活动的调节。钙调神经磷酸酶A亚基(Calcineurin A，CaN)外源性抑制剂如环孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)、他克莫司(Tacrolimus，FK506)等通过抑制CN/NFATc信号通路在治疗CaN相关炎性反应及免疫相关疾病中具有重要作用。由于CN 外源性抑制剂对各器官组织的 CN 无选择性，全身应用不良反应较大，其内源性调节因子RCAN1近来研究受到逐渐重视。近年来研究发现RCAN1在血管平滑肌细胞增殖、血管生成、动脉粥样硬化形成，血管内膜增生等过程中发挥着一定调节作用。RCAN1及其通路在血管疾病领域研究的阐明有望为血管疾病治疗提供新的策略。

1RCAN1分子结构

RCAN1基因亦称作唐氏综合征关键区域1基因(Down Syndrome Critical Region 1 gene,DSCR1),是阿尔茨海默病和唐氏综合征等相关疾病发病机制中起着关键作用的基因[2]。RCAN1基因包含7个外显子，其中外显子1-4均可替代第一外显子选择性剪切产生RCAN1-1、RCAN1-2、RCAN1-4等3种不同的mRNA 转录产物，外显子5-7在上述转录产物中均有表达[3]。RCAN1亚型表现形式及转录机制各不相同，外显子2在胎儿的脑和肝中表达，外显子1和外显子4在胎儿的脑组织、肝组织、肾及成人的大多组织中表达且表达存在差异[4]。RCAN1-1和RCAN1-4是主要的转录产物亚型。RCAN1亚型的不同表现形式与不同的转录机制有关RCAN1-1在许多组织中存在表达，在受到刺激及CN/NFAT信号通路激活后，RCAN1-4才开始转录。RCAN1-4可通过与CN和GATA信号通路调节，而RCAN1 1通过Notch和Hes-1相关的信号通路调节[5]。RCAN1内源性调节CN作用可能与RCAN1磷酸化状态有关，如细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Dyrk1A、TGFβ激活的蛋白激酶1(TAK1)、NF-kB诱导激酶(NIK)。PKA[6]等通过RCAN1 的Ser 93，Ser 108，Ser 112，Thr 124，Thr 153等不同位点参与RCAN1磷酸化调节。RCAN1蛋白可通过泛素-蛋白酶体系统和溶酶体自噬通路降解，FBW7、FBXW1、Nedd4-2、STAT2、USP22等因子可通过泛素化RCAN1参与RCAN1蛋白水平的调节，从而影响RCAN1相关的病理生理过程调节[7]。

2RCAN1的作用机制

目前研究认为RCAN1是CN的一种内源性调节因子，RCAN1通过其外显子PxIxxT结构域与钙调神经磷酸酶亚基A相互结合，通过调节CnA信号通路相关的多种病理生理。CN 在组织中分布广泛，其在心血管系统中、神经系统中、运动系统及肿瘤等多个系统中发挥着生物学效应。 CN是一个由催化亚单位(CnA) 和调节亚单位(CnB) 组成的二聚体结构，其在体内钙、钙调节蛋白浓度增加后与CN 结合后进而诱发CnA 构象的改变，致使自身抑制或移位，暴露出活性位点，导致CN活化，活化的CN通过下游活化的T细胞因子(NFAT)去磷酸化而发挥生物学效应。研究报道RCAN1对CN调节起双重作用，一方面RCAN1对CN具有抑制作用，RCAN1可通过抑制CN/NFAT信号通路参与多种病理生理过程；另一方面RCAN1可活化CN信号通路，其可能与RCAN1磷酸化有关。RCAN1 的保守区域SP 被糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)磷酸化[8]，RCAN1降解，激活CN，活化的CN通过对下游产物NFAT、tau、CREB、BAD等去磷酸化；去磷酸化的底物转位入核，参与多种基因的调控，参与多种疾病的病理生理过程。

3RCAN1在血管领域研究进展

3.1RCAN1在炎性反应中的作用：炎性反应与免疫反应是多种心脏及血管疾病的发病基础，炎性反应的发生与多种信号通路有关，近些年来研究显示RCAN1通过NFAT通路与NF-KB通路在炎性反应通路中具有重要作用[9]。一方面RCAN1通过与CN结合、抑制NFAT底物磷酸化及NFAT转位入核、从而抑制了NFAT调节的下游基因转录，进而对T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞等免疫细胞诱导产生的IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，TNF,GM-CSF 多种炎性因子调控，参与炎性反应调节[10-11],另一方面RCAN1通过与IkBa相互作用，减少了IkBa磷酸化，增加了其稳定性，抑制NF-kB信号通路进而参与炎性因子转录相关基因的调控[12]。Takashi等对脐静脉内皮细胞DNA微阵列分析发现过量表达的NFAT可上调51个与凝血酶诱导内皮细胞相关的基因；RCAN1过表达可促使凝血酶诱导的内皮细胞基因下调三分之一，其中包括VCAM-1基因，进一步说明RCAN1通过NFAT通路上调炎症因子表达。此外Yuan等研究显示RCAN1调节炎性反应与MicroRNA-34a有关[13]，在人脐静脉内皮细胞培养中发现MicroRNA-34a转录增加，可导致RCAN1表达水平增加，NFATC1及nfkb水平也显著增加。但研究发现RCAN1对炎症具有抑制作用，Junkins等通过对呼吸道感染炎性反应模型研究提出RCAN1对炎性反应具有抑制作用，并推测其可能与STAT3通路与炎症调节有关[14]。张小鸿等研究发现，在氧化应激导致[15]。细胞凋亡时，RCAN1的过表达可对氧化应激所导致 细胞凋亡具有一定程度的保护作用，并推测RCAN1 其可能负向调节NLRP3炎性相关的信号通路活化信号，抑制 IL -1β等炎性因子产生。但Peters等对RCAN1在牙周炎疾病中研究发现[16]，牙周内皮细胞研发现在牙周内皮细胞慢性炎性反应时RCAN1表达受到抑制，而在急性炎性反应时RCAN1表达上调，其可能RCAN1对炎性反应调节与细胞、组织的种类，不同刺激及疾病的进展程度及其他信号通路参与调节有关。

3.2RCAN1在血管内皮细胞中的作用：血管内皮细胞是覆盖于血管腔组织表面的一层单层细胞，在维持血管渗透性、传递血管信息交换及分泌调节血管活性相关物质等方面起关键作用。内皮细胞活化或缺失在动脉粥样硬化、炎性反应、血管生长及肿瘤生长等病理过程中起着重要作用[17]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种潜在的促血管生成调节因子，其在缺氧或在炎性反应刺激下分泌[18]。研究示RCAN1在脐静脉、人主动脉、人皮肤微血管及人视网膜等血管的内皮细胞均有表达，在VEGF刺激下RCAN1.4表达上调；RCAN1基因敲出后，在VEGF刺激作用体外内皮细胞迁移明显受到抑制，其病理机制可能与RCAN1与CN/NFAT信号通路负反馈调节有关。Ahmad等研究认为，RCAN1调节血管内皮细胞还可能与调节有关，RCAN1通过CN/NFAT信号通路和PKC信号通路调节RCAN1.4表达，进而促进内皮细胞迁移[19]。此外Li等在低氧诱导脐静脉内皮细胞凋亡研究发现RCAN1-L过表达明显降低了线粒体质量[18]，减少去极化线粒体，下调ATP和活性氧的产生，通过刺激线粒体细胞发生自噬反应，进而调节细胞的凋亡，此外研究认为RCAN1参与细胞氧化应激所导致损伤调节可能与氧化应激创伤导致RCAN1过表达，进而抑制CN活性有关。另有研究显示，RCAN1可通过下调一氧化氮合成酶(nitric oxide endothelial synthase，eNOS) 活性，促使体内NO的浓度降低，进而引起内皮功能障碍等相关疾病[20]。

3.3RCAN1在血管生成中的作用：新生血管生成是胚胎发育、器官生长，组织修复必不可少的生理过程，近年来研究显示RCAN1在血管生成调节中具有重要的调节。血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF的受体被认为是当前在调节血管生成生理及病理过程中的一个重要调节物质。当前研究发现CN/NFATc信号通路的活化可具有促进VEGF所诱导的血管生成作用[21]，其可能与VEGF及VEGF 2受体(VEGF-2)与血管内皮的细胞结合同时并通过CN/NFAT信号通路活化转录Cox-2等血管生成基因进而参与血管的生成调节[22]。此外在动物模型中研究发现，在使用CsA处理后VEGF诱导的血管生成显著减少。RCAN1为CN内源性调节因子，其可能参与血管生成的调节过程。 Mayumi等通过对脐静脉内皮细胞cDNA芯片对7267人类基因分析鉴定VEGF诱导血管生成和血管通透性基因研究发现RCAN1是其中一个高诱导的基因[23]。Jimin等在小鼠肺部肿瘤模型中研究发现RCAN1可通过抑制CN活性从而对肿瘤组织血管生成的调节起着抑制作用[24]。在体外实验中RCAN1过表达可明显减少内皮细胞增殖，但RCAN1.4基因敲出后内皮细胞增殖明显加快，此外Qin研究发现在VEGF诱导下RCAN1-1可诱导血管生成，而RCAN1.4对血管生成却有抑制作用[25]，表明RCAN1对血管调节可能与其亚型有关。 Masakazu等通过对脐静脉血管RCAN1表达研究发现RCAN1在管腔大分支少的组织中表达显著高于分支多管腔小的血管组织[26]；在体内研究发现，蟾受精卵内注射RCAN1 mRNA，RCAN1过表达组蟾肌节间的血管分支明显减少，提示RCAN1可能与不同大小血管组织的生成中起着不同调节作用。

3.4RCAN1在血管平滑肌增殖中的作用：血管平滑肌细胞(VSMC)具有维持血管的完整性和稳态功能，VSMC表型转变、异常增殖、凋亡以及细胞外间质成分组成改变进而引起的血管组织重塑是血管动脉瘤、血管支架植入术后再狭窄及新生动脉粥样硬化等多种心血管疾病发生及发展中重要病理基础[27]。平滑肌增殖与多种信号通路有关，既往研究显示Ca2+/CaM-CN-NFAT信号通路激活对VSMC增殖信号转导中发挥着重要促进作用，研究发现G蛋白偶联受体激动剂、酪氨酸蛋白激酶受体激动剂等在不同因子刺激作用下，通过NFATc去磷酸化转位入核，调节多种活性因子及促VSMC增殖相关基因转录，调节VSMC增殖和迁移[28]。在小鼠的球囊损伤模型中，在球囊扩张术后其动脉管腔的狭窄与 CaN 信号通路活化有关[29]，使用钙调神经蛋白的外源抑制剂CsA明显减轻球囊损伤造成的血管狭窄[30]。RCAN1对CN/NFAT信号通路起着关键的调节作用，RCAN1可能通过该信号通路的调节进而参与VSMC调节。血管紧张素Ⅱ已经被证明是诱导VSMC增殖活性分子，全基因组分析显示> 1500基因与血管紧张素II诱导VSMC有关，其中与CN活性有关有11个基因，而RCAN1基因与CN活性最为密切，提示RCAN1可能参与VSMC调节；Esteban等研究发现RCAN1在血管紧张素Ⅱ(AngII)诱导的VSMC增殖起着着重要的作用，在AngⅡ诱导下，RCAN1基因敲出后小鼠VSMC增殖明显低于对照组，在体外细胞实验中也证实RCAN1对AngⅡ诱导VSMC增殖具有一定的促进作用[31]，但目前在人体血管VSMC增殖还未明确。Monica Y等指出RCAN1通过损伤诱导VSMC表型转换调节，其通过对CN/NFAT通路反馈调节有关[32]。

3.5RCAN1在动脉粥样硬化中的作用：动脉粥样硬化是造成心肌缺血、脑卒中及外周血管闭塞疾病主要原因。当前研究认为RCAN1蛋白在血管动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)早期的形成过程里可能具有促进作用。研究显示RCAN1是一种潜在的致AS因子，Nerea等通过人体冠状动脉AS的斑块分析发现RCAN1在有AS斑块的冠状动脉组织中显著高于非动脉粥样硬化冠状动脉[33]。其在小鼠动脉组织AS模型中观察发现RCAN1在高脂饮食组表达高于正常饮食组，RCAN1基因敲出组其斑块面积及内膜与中膜比显著要低于对照组，提示抑制RCAN1表达可能对延缓AS进程有关。此外，炎性反应也是导致动脉粥样硬化进展的一个必不可少因素，研究显示RCAN1能够抑制NF-KB活性，且可参与炎症的调节。此外研究显示使用CsA药物可抑制RCAN1-CN-NFAT信号通路，降低动脉粥样硬化进展及维持血管的完整性[34]。氧化低密度脂蛋(oxLDL)和巨噬细胞吞噬作用是导致动脉粥样硬化主要原因，RCAN1调控oxLDL机制目前还不清楚，还有待于进一步研究。

4 展望

随着我国逐步进入老龄化社会，血管疾病已逐渐成为导致人们健康的主要疾病。血管炎性反应、动脉粥样硬化、平滑肌增殖等作为心血管疾病共同病理基础，有效的治疗和预防对控制和延缓疾病的发生、发展具有重要的意义。RCAN1在血管组织的内皮细胞、VSMC的增殖、血管的生成、动脉粥样硬化的形成、炎症及血管的功能方面发挥着重要作用,对临床介入术后支架内再狭窄、动脉硬化、动脉瘤等血管疾病及肿瘤的治疗和预防提供新的途径。目前RCAN1与血管疾病研究不多，基础研究大多局限于动物和细胞实验，RCAN1与人体血管疾病的研究还不是很清楚，RCAN1是否通过CN/NFATc信号通路或与其他信号通路共同参与血管疾病调节及相关调节机制还有待于进一步探讨研究。

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