猪流感病毒的进化及其对人类的威胁

卜欣欣, 龙进学, 顾 敏,3*, 刘秀梵,3*

(1. 扬州大学 兽医学院，江苏扬州 225009；2. 苏州艾棣维欣动物药品有限公司，江苏苏州 215100；3. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

猪流感(Swine influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，以发病突然、传播迅速、康复快、死亡率低为特征，是集约化、规模化猪场常见的季节性疾病，常见的病毒亚型包括H1N1、H3N2和H1N2等，各亚型猪流感在世界各国均有发生和流行，给养猪业造成了严重的经济损失[1-2]。另外，猪流感也对人类健康构成了严重的威胁。一方面，由于猪的呼吸道上皮细胞同时具有识别和结合人流感病毒与禽流感病毒的唾液酸受体，被证实是人和禽流感病毒重要的中间宿主，发挥着基因“混合器”(Mixing vessel)的作用。多种流感病毒的共感染，使猪体内的流感病毒不断发生基因重组和进化变异，而新产生的变异病毒可能具有危害公共卫生安全的潜在风险[3]。另一方面，猪流感病毒可以突破种间屏障，直接由猪传播至人，部分病毒株还可在人际间有效传播。例如，距离我们最近的2009 H1N1流感大流行，其病原的多个基因片段均与猪流感病毒关系紧密，被认为最可能来源于猪流感；而且病毒适应人群后表现出了在人群中高效传播的特性，严重病例可以导致重症肺炎和呼吸衰竭并引起死亡[4]。因此，掌握猪流感病毒的基因组进化规律，了解其在猪群中的流行状况及对人类的潜在威胁，可以为大流感预警的相关研究提供参考。

1 猪流感概述

1.1 猪流感病毒的基因结构

猪流感病毒属于A型流感病毒，病毒粒子形态多样，多数呈球形，直径约为80～120 nm。病毒基因组为有囊膜、单股负链、分8个节段的RNA，编码的蛋白至少包括碱性聚合酶2(Polymerase basic 2, PB2)、碱性聚合酶1(Polymerase basic 1, PB1)、酸性聚合酶(Polymerase acid, PA)、血凝素(Hemagglutinin, HA)、核蛋白(Nucleoprotein, NP)、神经氨酸酶(Neraminidase, NA)、基质蛋白1(Matrix protein 1, M1)、基质蛋白2(Matrix protein 2, M2)、非结构蛋白(Nonstructural protein 1, NS1)和核输出蛋白(Nuclear export protein, NEP)等[5]。病毒RNA聚合酶复合体vRNP由3种聚合酶蛋白PB2、PB1和PA以及NP组成，具有转录和核酸内切酶活性。HA是病毒的主要囊膜糖蛋白，由前体形式HA0裂解为HA1和HA2后，对于细胞融合以及结合细胞表面受体均起到重要作用。NA可清除细胞表面的唾液酸受体，有利于子代病毒粒子的释放和进一步感染细胞。M1除具有维持病毒形态的作用外，还可调节病毒转录酶活性，对于子代病毒粒子的装配起重要作用；M2是离子通道蛋白。NS1主要作用是抵抗干扰素介导的抗病毒反应；NEP蛋白可影响病毒RNP的聚合酶活性[5]。目前，根据HA和NA的抗原性差异，可以将A型流感病毒分为18个HA亚型(H1～H18)和11个NA亚型(N1～N11)[4]。

1.2 猪流感的简史

据资料记载，1918年美国Iowa猪展上，有部分猪发病严重甚至死亡，将健康猪与幸存猪接触后也出现了同样的症状，且出现的临床和病理学症状与人流感有很多相似之处，因此Koen等人将其称为“流感(Influenza)”[6]。直到1930年，美国研究员Shope才首次证实了此病由猪流感病毒引起，并且从北美猪群中分离到了第一株H1N1亚型猪流感病毒，属于经典猪流感病毒(Classical swine H1N1，CS H1N1 SIV)[7-8]。

目前，全世界各地区主要流行的猪流感病毒有三种亚型：H1N1、H3N2和H1N2亚型。但由于地域差异，各亚型病毒基因片段的来源不尽相同，主要有经典猪流感H1N1、欧亚类禽H1N1、类人H3N2、基因重配的H3N2及多基因型的H1N2亚型[1-2，9]，表现为遗传多样性。所谓“类”，表示病毒的最初宿主来源，这是流感病毒跨物种传播的结果[2]。此外，还从猪群中分离到了未能在猪群稳定流行的亚型，如H1N7、H2N3、H3N1、H3N3、H3N6、H3N8、H4N6 、H4N8、H5N1、H7N2和H9N2[1-2，5，9]。

1.3 猪流感的症状

猪流感病毒可引起不同日龄、性别和品种猪发生急性、热性和高度接触性、群发性呼吸道疾病，其临床上以突发高热、咳嗽、喷嚏、呼吸困难、妊娠母猪流产或繁殖性能下降为主要症状。猪流感单独感染的结果仅为病毒性肺炎，若无其他病原感染情况下，感染猪在疾病暴发后恢复很快。然而，猪流感病毒感染猪后，通常会损害猪的免疫系统，造成免疫力下降，甚至免疫抑制，使得猪易于继发感染或混合感染猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪支原体肺炎、链球菌病和胸膜肺炎放线杆菌病等疾病，给养猪业造成重大的经济损失[1，8]。

人也可以感染猪流感病毒。感染病毒的猪或人是主要的传染源，隐性感染者也具有传染性。人感染猪流感的潜伏期尚不明确，参照流感的潜伏期一般为1～3 d。临床症状与流感相似，包括发热、咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有些人还会出现腹泻和呕吐，甚至引起严重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡，威胁人类健康[6]。

2 猪流感病毒的基因组进化

2.1 重要氨基酸位点的突变

研究表明，猪流感病毒蛋白的重要氨基酸位点发生突变，会对其功能或病毒特性产生重要影响。例如，HA蛋白的226位是影响病毒宿主特异性的主要因素。L226对唾液酸(SA-α-2, 6-Gal)有较高的亲和力，主要感染人类呼吸道上皮细胞；Q226对唾液酸(SA-α-2, 3-Gal)有较高的亲和力，倾向于特异性结合禽类上皮细胞；而M226可同时结合禽源和人源受体[4]。另外，当1918大流感H1N1亚型流感病毒HA蛋白发生E190D和/或G225D/E的位点突变时，可能导致其受体结合特性由偏嗜禽源SA-α-2,3-Gal转变为人源SA-α-2, 6-Gal[10-11]。除此之外，PB2 蛋白的 271 位、 627 位和 701 位氨基酸位点可以影响 A型流感病毒对宿主的选择，也是病毒致病力的重要决定位点。发生T271A 突变能显著增强 PB2 多聚酶活性，增加对哺乳动物的感染能力[12]；当第627位由E突变为K时，流感病毒的毒力明显增强，转变为高致病性，已成为重要的分子标记；701位氨基酸为N时，重组病毒可获得在哺乳动物宿主内进行复制和传播的能力[12-13]。若NS1蛋白92位氨基酸为D时，病毒表现为低致病性；当突变为E时，则病毒的致病力增强[13]。M2蛋白跨膜区域是金刚烷胺类药物的作用靶点，当存在L26F、 V27A、 A30T、 S31N和G34E等氨基酸变异中的至少一个位点突变就会导致耐药毒株的出现。同样，NA 蛋白若出现 H274Y、N294S的氨基酸位点变异，病毒就会对达菲、扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂类的抗流感病毒药物不敏感[14]。

2.2 基因片段的重组

由于A型流感病毒基因组分节段的特性，当两个或多个病毒株共同感染宿主细胞时，就有可能发生相互间RNA片段的交换[15]。并且，在转录和复制过程中，每个vRNP都可以作为独立的功能单元，又增加了进行基因重配(Reassortment)的机会[16]。重组产生的新病毒有可能获得新的病毒特征，并可能具有在人群中引起流行甚至是大流行的潜在风险。普遍认为，除了1918大流感，历史上的几次流感大流行均与A型流感病毒的基因重配密切相关[17]。例如，遗传进化分析显示，1957年亚洲大流感的H2N2亚型病毒是在1918年H1N1大流行病毒的骨架上重组了类禽来源的PB1、HA和NA基因而产生，并发生了抗原性从H1N1到H2N2的转换。此后，该H2N2亚型病毒又进一步引入了类禽来源的HA和PB1基因，产生了另一种重组病毒，导致了1968年香港H3N2大流感[18]。而2009年始发于墨西哥的H1N1大流感也是基因重配的产物，其基因组的构成包括类禽来源的PB2和PA基因，人类季节性H3N2 亚型流感的PB1基因，CS H1N1 SIV的HA、NP和NS 基因，以及欧洲类禽猪流感病毒的NA和M基因[15,18]。

2.3 猪群中的流行情况

猪流感最初于1918大流感时期在美国被发现，1930年分离鉴定出其病原，为CS H1N1 SIV[7-8]。随后，该病毒就在亚洲和北美的猪群中广泛存在[19]。然而，1979年在比利时分离到一株全禽源基因的新型H1N1病毒，是由禽H1N1流感病毒跨物种传播到猪所产生，被命名为欧亚类禽H1N1猪流感病毒(Euroasian avian-like H1N1 SIV,EA H1N1 SIV)[2,19]。此后，这类病毒以其抗原性发生了显著改变的优势，迅速取代了CS H1N1 SIV，成为欧洲地区主要流行的猪流感病毒[19-20]。但在世界上的其他一些国家，CS H1N1 SIV依然在猪群中流行，并仍占据重要地位[20]。对于H3N2亚型猪流感病毒，最早在台湾地区的猪体内分离到了类人1968香港H3N2大流感病毒[21]，随后在世界多地的猪群中也检测到该病毒。H1N2亚型猪流感病毒则于1978年在日本首次被分离，是CS H1N1 SIV的基因骨架重组了类人H3N2大流感病毒的NA基因而产生的重配病毒，并在日本广泛传播[22]。并且，1994年来，包括英国在内的许多国家从猪群中分离到了多种复杂基因型的H1N2亚型流感病毒[22-23]。

在我国，猪流感于1969年首次分离于台湾地区的猪群中，为类人H3N2香港大流感病毒[21]。此后，国内大部分地区猪群中均有该病毒的流行。1991年，郭元吉等[24]首次从北京地区猪群中分离出了CS H1N1 SIV。1993～1994年，EA H1N1 SIV开始在国内出现，并与CS H1N1 SIV在华南地区形成共同流行[25]。2004年，第一例H1N2亚型猪流感病毒感染出现在浙江猪群中[8]。近年来，国内猪群中还分离出由禽流感病毒的PB2和PA、类人H3N2大流感病毒的PB1和NA，以及CS H1N1 SIV的HA、NP、M和NS基因重组而成的三源重组H1N2亚型流感病毒[22,26]。2005年后，尽管也能从猪群中分离到CS H1N1 SIV和三源重组H1N2流感病毒，但EA H1N1 SIV开始占据主导地位，并且类人H3N2大流感病毒逐渐消失[27]。2009年H1N1流感大流行后的两三年内，该病毒广泛流行于江苏、湖北以及广东等地区猪群[28-29]；而此后分离到的多是与其它病毒重组产生的重配体。此外，还从猪群中零星地分离到许多其它亚型，如具有全禽源基因组的H9N2、H5N1、H4N8、H6N6亚型流感病毒，以及含有马源基因的H3N8亚型流感病毒，但这些病毒尚未在猪群中建立稳定流行[8,25,27]。

3 猪流感病毒对人类的威胁

3.1 猪流感病毒直接感染人

北美、欧洲和亚洲分别于1974年、1983年、1999年首次从人身上分离到猪流感病毒，分别是CS H1N1 SIV，EA H1N1 SIV和H3N2亚型猪流感病毒[30-32]。这说明猪流感病毒在自然条件下可以感染人类。另外，2002年和2008年分别发生在瑞士和西班牙的2例人感染猪流感病毒案例，感染的病毒均为EA H1N1 SIV，且感染者均有猪群暴露史[33]。而2009年始发于墨西哥的H1N1流感大流行波及了215个国家，造成了数十万人的死亡，更是成为猪流感病毒发生基因重组并突破种间屏障感染人的有力证据[24,34]。遗传进化分析表明，该病毒基因组同时含有猪、禽和人流感病毒的基因片段，分别是：NA和M基因来源于1979年以后在欧亚大陆流行的EA H1N1 SIV；HA、NP和NS基因来源于北美猪群中的CS H1N1 SIV； PB2和PA基因来源于自1998年引入到北美猪群的禽流感病毒；PB1基因则来源于人类季节性H3N2 亚型流感病毒[19,22]。进一步的重组研究发现，2009 H1N1大流感病毒的PA，NA，M和NS基因可能有助于产生的重组型流感病毒的传播[35]。2011年，一名中国儿童感染EA H1N1 SIV后患严重肺炎，并最终死亡，这也是中国大陆第一例人感染猪流感病毒事件[36]。

3.2 人群中血清阳性率情况

目前，利用血清学方法调查人群中禽流感病毒感染率的研究较多，而评估人群中猪流感病毒抗体水平的调查却相对较少，因此人群中猪流感病毒的流行情况尚待完善[6]。2007年，国外学者对墨西哥某大型猪肉生产州的工作人员(暴露人群)和非工作人员(未暴露人群)就人群中人季节性H3N2、H1N1亚型流感病毒以及H3N2、H1N1亚型猪流感病毒共4种病毒的血清阳性率进行了调查研究，发现仅H3N2和H1N1亚型猪流感病毒的暴露人群血清阳性率显著高于未暴露人群；并且暴露人群对H3N2亚型猪流感病毒的血清阳性率明显高于H1N1亚型猪流感病毒[37]。2014年，国内也有相关研究表明猪场工作人员对H3N2亚型猪流感病毒(该检测病毒为经典H1N1猪流感病毒和人H3N2流感病毒组成的二源重组病毒)的血清阳性率同样明显高于非猪场工作人员[33]。鉴于此，包括墨西哥和中国在内的许多国家和地区进行了人群中猪流感病毒抗体水平的相关研究[37-38]，这些血清学调查结果表明从事养猪业的人员，特别是频繁接触猪群者，如猪肉加工处理人员、兽医等，被猪流感病毒感染的风险要高于普通人群。

4 结 语

基因重组是A型流感病毒进化和跨宿主传播的重要过程之一，也是新型流感病毒产生的主要机制。猪流感病毒可以突破种间屏障，直接由猪传播至人，危害人类健康。此外，部分变异病毒株还可在人际间进行传播，对于引发新的流感大流行是一个很大的威胁。随着经济社会的不断发展，大型集约化养猪场的兴起逐渐替代了传统的散户养殖模式，一定程度上降低了多种宿主来源的流感病毒在猪体内进行基因重配并产生具有潜在危害性重组病毒的可能，但该风险依然存在。因此，加强猪流感病毒的分子流行病学监测研究，对于可能由猪流感病毒的持续进化和变异而引发的流感大流行预警具有重要意义。