不同日龄雏鸡组织器官IgY的分布及含量比较

巨晓军，马尹鹏，杨海明，王志跃

(1.江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125；2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；3.扬州大学 农业科技发展研究院，江苏 扬州 225009)

卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY)是种母鸡被免疫后体内产生相应的抗体，能够通过母鸡的血液循环沉积在卵黄内。当卵黄被雏鸡吸收后，IgY随其它营养物质一起进入雏鸡体内，到7日龄时这部分抗体(IgY)才被雏鸡自身产生的IgA取代，雏鸡也逐渐建立起自己的免疫力[1]，因此IgY是雏鸡主要的母源抗体，卵黄囊中IgY的转移利用情况对雏鸡的生长发育和健康状况至关重要[2]。Sun等[3]研究发现，产蛋鸡对IgY有浓集作用，鸡蛋卵黄中的抗体浓度高于血浆。IgY具有许多独特的优点和作用[4-8]，作为饲料添加剂对畜禽生产、免疫及疾病防治方面也有广泛的应用[9-11]，然而有关雏鸡自身携带的母源IgY转移和利用研究却少有报道。以前的试验研究中，只表明在雏鸡卵黄囊和血清中存在IgY，并且仅仅是对鸡胚或雏鸡初生早期在卵黄囊或血清中IgY的含量变化进行研究[12-13]，鸡胚血清中吸收的蛋白含量并不与卵黄中母源抗体下降的蛋白含量相等[13]，其它的母源抗体在机体中的分布情况很少有研究报道。本试验主要研究了IgY在组织器官中的分布，并对不同日龄雏鸡组织器官中IgY浓度和含量进行了比较。

1 材料与方法

1.1 试验材料

ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；海兰白种蛋购自仪征市大巷永康种鸡场。

1.2 试验设计

选取蛋重、蛋形指数基本一致的同日产海兰白种蛋进行人工孵化，出雏后常规饲养一周，饲养环境温度1～3日龄为33～35 ℃、4～6日龄为32～33 ℃，24 h光照，正常饮水、开食。参照美国NRC(1994)营养需要并结合本品种实际情况配制粉状开食配合饲粮，饲粮组成及营养水平见表1。分别在出雏后1、2、3、4、5和6日龄随机取20只公雏鸡采血、屠宰，分离组织器官，称重，测定IgY含量。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis)

注：①预混料为每千克饲粮提供:VA 11 000 IU,VD33 000 IU,VE 15 IU,VK320 mg,VB110 mg,VB230 mg,VB620 mg,VB120.2 mg,烟酸600 mg,泛酸180 mg,叶酸10 mg, 生物素 0.8 mg,胆碱7 mg, Fe(FeSO4)1.2 g, Cu (CuSO4)0.2 g, Mn (MnSO4)1.9 g, Zn(ZnSO4)1.8 g, I (KI) 10 mg, Se(Na2SeO3) 6 mg。②营养水平均为计算值。

Note: ①The premix was provided as follows per kg:VA 11 000 IU,VD33 000 IU,VE 15 IU,VK320 mg,VB110 mg,VB230 mg,VB620 mg,VB120.2 mg, nicotinic acid 600 mg, pantothenic acid 180 mg, folic acid 10 mg, biotin 0.8 mg, choline 7 mg, Fe (as ferrous sulfate)1.2 g, Cu (as copper sulfate)0.2 g, Mn (as manganese sulfate)1.9 g, Zn (as zinc sulfate)1.8 g, I (as potassium iodide) 10 mg, Se (as sodium selenium) 6 mg.②Nutrient levels were calculated values.

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 卵黄囊、肌胃、肝脏、肠道(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠)(去除肠道内容物)、脾脏、胸腺和法氏囊。

1.3.2 样品的处理 组织称重，-20 ℃保存备用。测定时将样品按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例匀浆，将制备好的10%匀浆液2 500 r/min离心10～15 min，取上清液立即进行测定(稀释过的上清液不可冷冻保存后再进行测定)。

心脏采血，分离血清，-20 ℃保存备用。

1.3.3 检测方法 使用鸡IgY ELISA试剂盒检测卵黄IgY水平，空白、标准品及每个样品分别设置2个重复，用OD450吸收值的平均数作为衡量IgY水平的值。根据标准品IgY浓度及对应OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品OD值在回归方程上计算出对应的样品IgY浓度。

器官IgY含量=器官IgY浓度×器官重

肠道IgY含量=肠道各段IgY浓度×各段肠道重的和

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2007进行整理，用SPSS 20.0统计软件进行分析，单因子方差分析(one-way ANOVA )检验组间差异显著性，P<0.05表示差异显著。试验结果用“平均数±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 标准品的测定

由表2、图1可知，组织器官IgY浓度与OD值的线性回归方程为：y=154.48x+3.3851，式中x是OD值，y是组织器官IgY浓度，R2=0.997。

2.2 雏鸡组织器官内IgY的分布

2.2.1 不同日龄雏鸡卵黄囊内IgY浓度 由表3可知，1～6日龄雏鸡卵黄囊内IgY的浓度变化差异不显著(P>0.05)。

2.2.2 不同日龄雏鸡血清IgY浓度 由表3可知，血清IgY浓度在雏鸡6日龄时显著低于其它日龄(P<0.05)，其它日龄浓度差异不显著(P>0.05)。

表2 标准品IgY浓度及对应OD值Table 2 Concentration of standard IgY and the OD values

注：原倍标准品IgY浓度为800 μg/mL，采用倍比稀释。

Notes: Concentration of original standard IgY was 800 μg/mL. Double dilution method was used.

图1 IgY标准曲线Fig.1 Standard curve of IgY

2.2.3 不同日龄雏鸡组织器官内IgY浓度 由表4可知，脾脏1、2日龄的IgY浓度显著高于其它日龄(P<0.05)，其它组织器官内IgY浓度从雏鸡1日龄到6日龄浓度差异不显著(P>0.05)。

2.3 雏鸡组织器官IgY含量比较

2.3.1 雏鸡肠道IgY含量比较 由表5可知，雏鸡1日龄时，十二指肠IgY含量显著高于盲肠IgY含量(P<0.05)。雏鸡在2日龄至5日龄时，十二指肠、空肠、回肠IgY含量显著高于盲肠、直肠IgY含量(P<0.05)。雏鸡6日龄时，十二指肠、盲肠、直肠IgY含量显著低于空肠、回肠IgY含量(P<0.05)，空肠IgY含量显著高于回肠(P<0.05)。

表3 雏鸡不同日龄卵黄囊和血清内IgY浓度 Table 3 Concentration of IgY from chicks' yolk sac and serum in various ages

注：同行数据肩标为相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Notes: In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same below.

表4 雏鸡不同日龄组织器官内IgY浓度Table 4 IgY concentration in chicks' organs in various ages

表5 雏鸡肠道IgY含量比较Table 5 Content comparison of IgY from chicks' intestines

2.3.2 雏鸡内脏器官IgY含量比较 由表6可知，雏鸡1日龄、2日龄时，肠道、肝脏内IgY含量显著低于肌胃IgY含量(P<0.05)。雏鸡在3日龄、4日龄、5日龄、6日龄时，肠道、肝脏、肌胃之间IgY含量差异均显著(P<0.05)。雏鸡1日龄、6日龄时，脾脏、胸腺、法氏囊之间IgY含量差异均显著(P<0.05)；2～5日龄时，脾脏与法氏囊IgY含量均显著低于胸腺IgY含量(P<0.05)。在雏鸡组织器官中IgY的含量由高到低排列依次是：肌胃、肝脏、肠道、胸腺、法氏囊、脾脏。

表6 雏鸡内脏器官IgY含量比较Table 5 Comparison of IgY content in chicks' internal organs

注：同列数据肩标为相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Notes: In the same collum, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01).

3 讨 论

3.1 IgY在组织器官中的分布

雏鸡6日龄前由于免疫器官没有发育完全，自身不能产生抗体，其体内抗体均来源于母源抗体。IgY是卵黄内主要的球蛋白，对鸡胚孵育过程中及孵育后起保护作用[14]。在正常情况下，母源抗体并不被消化从而完整地保留下来，在孵化后可完全发挥功能[2]。在雏鸡出壳前，卵黄囊被吸进雏鸡体内，卵黄囊内的物质将在出壳后一周被逐渐吸收。有研究表明，IgY在种蛋孵化后的第7天就开始从卵黄囊内转移，但开始高水平的转移是在卵黄囊吸入腹腔后开始的[15]，卵黄囊内的IgY转移后其分布情况鲜有报道。雏禽出壳后，血液中的IgY可为机体提供强有力的被动免疫，是禽类在长期进化过程中形成的用于提高雏禽抵抗力的物质[16-17]。本试验研究结果表明，血清IgY在1～5日龄没有变化，6日龄时有显著变化，雏鸡随着日龄的增大不断生长，体内血液总量不断升高，血清中IgY总量是不断增加的，表明IgY不断被转运到血清中，后期转运的速度加快，雏鸡抵抗疾病及外界应激的能力不断增强。

本试验测定的组织器官中均检测到不同浓度的IgY存在，表明除在卵黄囊和血清中存在IgY外，在机体组织器官内也存在IgY。在1～6日龄的雏鸡生长过程中，除免疫器官脾脏外其它测定组织器官中IgY浓度处于稳定的状态，变化范围不大，而雏鸡出壳后腹腔的卵黄囊被迅速吸收，重量显著下降[18-19]，说明IgY同卵黄囊内其它营养物质一起被机体转移吸收。Danny[20]的研究同样表明：雏鸡出壳前卵黄囊被吸收进入腹腔，卵黄囊中残存着的IgY转移至血液中，从而分布于机体的各个组织，如肝脏和小肠等。消化道是身体直接和外源物质接触的场所，外源饲料饮水会带进各种微生物包括有害菌，IgY在消化道沉积应该有助于在免疫系统未建立完善时帮助肠道这个天然屏障(或机体)抵抗外源微生物的入侵[21]。由此可估计，与外界接触的皮肤和肺中IgY含量也较多，但还需进一步研究和探讨。脾脏中IgY的浓度在3日龄后显著升高，可能是因为脾脏连接腹腔内最大的分支动脉，从卵黄囊内吸收的IgY被卵黄囊上的血管吸收进入血液循环，随脾动脉被吸收进入脾脏，在脾脏沉淀下来，并且脾脏体积小，生长缓慢，因此使得脾脏中IgY浓度最高。

3.2 组织器官IgY含量比较

从本试验研究结果可以看出，在测定的消化器官中肌胃IgY的含量最高，远高于肠道和肝脏，3日龄之前虽然肝脏中IgY的含量高于肠道中含量，但并未达到显著水平，3日龄之后肝脏中IgY的含量显著高于肠道中含量，说明在3日龄后IgY更快速地进入肝脏。雏鸡从1日龄到6日龄肠道内IgY含量从总体趋势看小肠的含量高于大肠，十二指肠、空肠、回肠IgY的含量相近，这可能是与组织优先生长发育的快慢有关，雏鸡肌胃相对增重在4日龄左右就达到峰值，而肝脏和肠道达到峰值时间是在7日龄左右[22]，因此肌胃组织液中优先存入较多的IgY。免疫器官IgY含量胸腺最高，其次是法氏囊、脾脏。脾脏中IgY浓度最高，因为其质量相对较小，但是其在免疫机能中仍发挥着重要的作用。

一般认为，IgY在雏鸡早期主要是通过肠粘膜与肠道病原微生物结合达到抗病能力，但IgY在雏鸡诸多组织器官中均有存在，且各组织间存在量差异较大，故我们认为IgY可能多途径发挥抗病作用。机体内的免疫球蛋白对雏鸡的免疫机能有着至关重要的调节作用，但由本试验结果可以看出免疫器官中IgY的含量相对较低，而肌胃中的IgY含量相对偏高，这可能与组织器官的生长发育快慢不同有关。

4 小 结

卵黄囊、肠道、肝脏、肌胃、胸腺、脾脏、法氏囊等组织器官及血清中均检测到IgY，1～6日龄除脾脏外其他组织器官IgY浓度未发生显著变化。在雏鸡组织器官中IgY的含量由高到低排列依次是：肌胃、肝脏、肠道、胸腺、法氏囊、脾脏。