全人源单克隆抗体制备技术的研究进展

唐亚华综述，胡慧明，朱美玲审校（南华大学附属南华医院：.药学部；2.内分泌科，湖南衡阳42002）

1975年，KOHLER等[1]通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。单克隆抗体具有专一性高、亲和力强等特点，已成为多种人类疾病诊断及治疗的重要工具。然而，鼠源性抗体在临床应用方面存在诸多缺陷。鼠源单抗应用至人体时，由于其来源于小鼠，具有免疫源性，会激活人体免疫系统，从而生成人抗鼠抗体，引发免疫损伤；鼠源单抗激活补体和Fc受体相关生物效应系统的特异性存在不足[2]。为了解决上述鼠源单抗存在的缺陷，科研工作者先后改造形成了嵌合型抗体和人源化抗体，但二者仍旧无法完全消除鼠源单抗的免疫源性，对临床疗效的改善依然有限[3]。为了进一步减少抗体的免疫原性，提高其临床疗效，研究者不断探索制备全人源抗体的新方法。全人源抗体是指完全由人类抗体基因编码而成的抗体，其免疫原性小、临床效果好，是未来单克隆抗体的主要发展方向[4]。目前，制备全人源抗体主要有噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术及单个B细胞抗体制备技术。本文将对以上3种应用广泛的全人源单克隆抗体制备技术做一简要综述。

1 噬菌体抗体库技术

1990年MCCAFFERTY等[5]首次成功将抗体片段在噬菌体表面展示，经过20多年的发展，噬菌体抗体库技术成为迄今最成熟、应用最广泛的抗体库技术之一。噬菌体抗体库技术的基本原理是：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增全套人抗体编码基因序列，经酶切后将抗体DNA序列插入噬菌体编码外壳蛋白结构基因的适当位置，建立噬菌体抗体文库，使抗体与噬菌体外壳蛋白相融合，并以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面。将构建好的噬菌体抗体库与目的抗原结合，通过抗原抗体特异性结合的原理，应用合适的筛选途径，将不能与目的抗原相结合的噬菌体洗脱，筛选出能与目的抗原特异性结合的噬菌体。再通过对目的噬菌体DNA测序，得到抗原特异性的人抗体基因序列，最终利用基因工程技术制备特异性全人源抗体[6]。

目前，利用该技术已成功构建了多个不同类型的scFv、Fab和sdAb抗体库并以此生产出多个应用于临床的全人源单克隆抗体[7]。噬菌体抗体库技术具有基因型和表型统一、筛选抗体周期短（最快只需1周）、筛选容量大等特点，理论上能够分离得到几乎所有抗原的特异性全人源抗体。然而，从噬菌体抗体库获得的抗体亲和力普遍较低，难以用于临床治疗。近年来，科研工作者通过创新优化筛选过程、增加靶抗原多样性等方法提高抗体的亲和力；利用易错PCR、DNA改组及基因深度测序等技术增加抗体库的库容和多样性，为噬菌体全人源抗体的广泛应用奠定了基础。截至2014年，美国食品药品监督管理局（FDA）总共批准了6个通过噬菌体抗体库技术生产的抗体投入市场，同时还有30多种利用此技术生产的抗体药物正处于各级临床试验阶段[6]。

2 转基因小鼠技术

1989年BRUGGEMANN等[8]首次将人IgH基因座转入小鼠体内，引起基因重排并表达IgM，证明了利用转基因小鼠制备人类抗体的可能性。随后科学家通过酵母人工染色体技术以及基因敲除技术成功构建了全人源抗体转基因小鼠，并将其公司化产业化，从而极大地推动了治疗性抗体市场化的蓬勃发展。转基因小鼠技术的基本原理是：应用相关基因工程技术破坏小鼠内源抗体基因，然后将人抗体基因转入小鼠体内，再将目标抗原免疫转基因小鼠，从而在其体内表达相应的抗体。该技术让抗原抗体免疫反应在小鼠体内进行，因此，保证了抗体类别转换的完整性、抗体克隆选择的多样性及抗体亲和力成熟的自然机理，如发生骨髓的抗体基因重排、淋巴结生发中心抗原诱导体细胞高频突变等，从而使通过该技术所得到的抗体具有良好的亲和性、稳定性和可溶性等。

目前，人们已经研发出微基因座、人工染色体及转染色体3代转基因小鼠制备技术，并通过这3类转基因小鼠成功生产出治疗银屑病、黑色素瘤、高胆固醇血症等多种疾病的全人源单克隆抗体[9]。但是，由于人和小鼠之间免疫系统组成存在差异，如何通过转基因小鼠获得更接近人体天然产生的抗体结构，仍然是研究者追求的目标。

3 单个B细胞抗体制备技术

单个B细胞制备全人源抗体的基本原理是：从人外周血、骨髓等来源分选B细胞，将单个B细胞分至盛有适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂的适当容器中，以此为模板进行反转录PCR扩增抗体基因序列。克隆至适当载体通过测序，分析评价插入、缺失和突变情况；再通过重叠延伸PCR方法将抗体基因片段连接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切将其连接至原核或真核载体内，在相应的系统中表达、纯化得到全人源抗体，最终用目的抗原筛选和鉴定抗体的特异性、亲和力等生物学特性。该技术保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、所需细胞量少等优势[10]。但在实际应用过程中，B细胞分选技术和后续PCR基因扩增技术是制约单个B细胞抗体制备技术应用的重要因素。

根据研究目的不同，单个B细胞分选方式分为随机分选和抗原特异性分选，样本来源包括外周血、淋巴组织及骨髓。单个B细胞的随机分选主要有显微镜挑选法[11]、激光捕获显微切割法[12]及荧光激活细胞分选法[13-14]。荧光激活细胞分选法以荧光剂和流式分选仪为基础，能够自动化分选单个B细胞，具有速度快、精确度高的优点，因此应用最为广泛。抗原特异性单个B细胞分选方法主要包括抗原标记磁珠分选法[15]、多参数荧光标记细胞分选法[16-17]及微阵列芯片法[18-19]。微阵列芯片法是将芯片表面制作许多小孔，每个小孔中只能容纳一个B细胞，随后用荧光标记的目标抗原识别特异性抗体，进而将检测到的能够分泌目标抗原特异性抗体的B细胞从小孔内转移至适当容器中进行后续操作。该技术具有高通量、效率高等优点，是目前分选单个B细胞技术中最先进、有效的方法之一。

由于抗体可变区基因序列的未知性，因此合理的引物序列在单个B细胞技术中至关重要，要求引物具有灵敏性、特异性，既能够避免非特异性扩增又能够有效地扩增出完整的抗体基因序列。通常针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区[10，20]。虽然基于混合引物的扩增方法已被证实能够扩增出部分抗体序列，但在引物多样性、扩增效率、特异性和抗体表达谱的还原等问题上仍需要改进[10]。OZAWA等[21]利用5'RACE技术，更加特异性地扩增出目的抗体可变区基因序列。此项技术在抗体基因多样性方面相比于前向引物混合物PCR方法具有优势，且此过程无须纯化PCR产物、省略了复杂的前向引物混合物，大大简化了反应体系[22-23]。

随着基于单细胞的抗体制备技术的不断开发和完善，通过该技术所产生的抗体具有全人源、高度抗原特异性和亲和力高等优势，单个B细胞抗体制备技术已逐渐成为单克隆抗体制备的主要技术[24]。但该技术还存在着诸如无法更高效地获取特殊抗原特异性的B淋巴细胞，无法更准确地制备抗体结合的单抗表位，无法提高所得到抗体的作用宽度等局限性。相信随着相关技术的优化和开发，单个B细胞抗体制备技术将得到进一步的发展和成熟，所制备的单克隆抗体也将在疾病的治疗、预防等方面具有无限的应用前景。

4 全人源单克隆抗体展望分析

自1986年美国FDA批准第一个治疗性单克隆进入临床以来，治疗性抗体发展迅速，截至2017年8月，FDA累计批准了69个治疗性抗体药物，其治疗范围包括肿瘤、免疫相关疾病（器官移植、自身免疫性疾病）及感染性疾病等，其中全人源单克隆抗体和人源化单克隆抗体已成主流[25-26]。虽然全人源单克隆抗体在保持亲和力、中和性及减少免疫源性方面与人源化单克隆抗体相比取得了显著成效，但由于人们对于抗体效应机制和机体免疫系统调节机制方面了解依然有限，全人源单克隆抗体的生产还存在着很多局限。随着相关研究的深入和技术的发展，全人源单克隆抗体的生产必将更加丰富多样，相关技术也将更加的先进和完善，越来越多的全人源单克隆抗体一定能够在人类疾病诊断和治疗领域发挥至关重要的作用。