林蛙油鉴别的研究进展

金 平，张 宇，王 会，兰 梦，张 辉，孙佳明

（长春中医药大学，长春 130117）

哈蟆油（Oviduetus Ranae）俗称田鸡油、哈蚂油、哈士蟆油，系蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinesis David）雌蛙的输卵管经干燥而得[1]。哈蟆油始载于《本草纲目》，具有补肾益精、养阴润肺等功能，主要用于身体虚弱、病后失调、精神不足、痨嗽咳血等症。哈蟆油作为传统而名贵的中药材，因其价格高昂，市场上同属和混伪品较多，药材的真伪鉴别更加的重要[2]。除传统的四大鉴定方法外，现在还有高效毛细管电泳、红外指纹图谱、HPLC指纹图谱、分子生物学等鉴别方法。

1 传统的鉴别方法

1.1 基源鉴别 中国林蛙外形似青蛙，体长约为7～9 cm。头部长与宽相等，吻端位置略突出于下颌。眼间距等于上眼睑宽度小于鼻间距，前肢短而后肢长且长度超过体长的一半，疣粒存在与胫跗关节前达眼，两侧褶间以及肩部并以 V形排列，肤色在季节不同时存在不同，秋冬较夏季略深，颜色分别为褐色和黄褐色，腹面为红黄色，有灰白色斑点块[3]。

1.2 性状鉴别 输卵管为黄白色并带有脂肪样光泽，可见毛细血管，长度为体长的4～8倍，重量为体质量的20%～26%，大小不一重叠成块状或片状。有些带有灰白色薄膜状干皮和黑色卵块，质地硬而脆。鉴别时以颜色偏白，个大肥厚有光泽，并且不存在黑色卵块和干皮为优[4]。

1.3 显微鉴别 滕淼娟[5]对哈蟆油及一种伪品癞哈蟆油进行显微鉴定。显微镜下通过对腺体细胞形状、排列、细胞壁及腺体纹理的区别，来鉴别哈蟆油的真伪。

1.4 理化鉴别

1.4.1 膨胀度 滕淼娟[5]运用温水试验哈蟆油迅速膨胀且体积增大至15倍且为白色棉絮状，而癞哈蟆油吸水少、膨胀慢不呈棉絮状，体积增大近7倍。而膨胀度测定按药典标准规定，不得低于55，真品为58符合规定，而伪品仅为21.8。

1.4.2 荧光鉴别 张琴等[6]根据真伪品在365 nm波长的荧光灯下显色不同进行鉴别，即正品为黄色荧光，伪品为亮蓝色荧光。

1.4.3 薄层色谱鉴别 徐阳[7]较原有的哈蟆油薄层鉴别方法，增加了胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇和 LD-2作为对照物质，在254 nm紫外灯光下，喷以10%硫酸乙醇溶液检视，此方法具有快速、准确、成本低廉等优势，可作为哈蟆油鉴别的参考方法。

2 仪器分析的鉴别方法

2.1 凝胶电泳法 富玉海等[8]运用凝胶电泳法鉴别正伪品哈士蟆油，正品有明显6个条带，伪品由于不纯而条带数量不明确。鲍悦等[9]分别取舒兰、桦甸、内蒙古、青海4个地区的哈蟆油作为正品哈蟆油，并将大蟾蜍输卵管作为伪品，将其进行 SDS- PAGE电泳的凝胶成像分析，结果得出4个不同区域的哈蟆油均有明显的6条主带，而伪品明显的谱带只有一条带。

2.2 HPLC指纹图谱法 白雪媛等[10]用95%乙醇作为哈蟆油提取溶剂，以乙腈- 0.5%磷酸溶液为流动相进行检测，运用色谱聚类分析得出不同品种之间存在显著差别。黄玉明等[11]对15批正品林蛙油其伪劣品进行 HPLC图谱分析比对，结论以相似度为0.85作为合格标准。李津明等[12]运用HPLC测定10批林蛙油样品的丙酮提取物，结果得出17个相应位置的共有峰作为鉴定林蛙油的指标峰。

2.3 红外光谱法 王永生等[13]分析不同产地来源的哈蟆油使用不同的红外光谱仪对同一药材进行了对比试验。根据不同产地的正品哈蟆油主成分种类相似在谱图中的存在相关系数建立了正品哈蟆油红外特征光谱，可作为哈蟆油的质量控制的依据。

2.4 紫外光谱法 王永生等[14]将收集到的7个不同的伪品和5种正品哈蟆油的有机溶剂超声提取液分别进行了紫外光谱法鉴别对比分析，且真伪品在峰形、吸收峰数量和峰位均有明显差别。

2.5 原子吸收光谱法和发射光谱法 王秋雨等[15]用原子分光光度计入和等离子发射光谱仪测定哈蟆油与青蛙油中微量元素和重金属的含量，结果显示两者均含有人体所必需的常用微量元素，但青蛙油中重金属含量超出标准范围。李媛媛等[16]采用等离子体发射光谱法对国产和俄罗斯产哈蟆油进行无机元素含量分析。

3 分子生物学

3.1 RAPD法鉴别 张晗思等[17]对哈蟆油及其4种常见混伪品碱裂解法提取基因组 DNA，2步循环PCR程序进行PCR反应，该方法在加入2 μL 100×SYBR Green I染料，正品显明亮绿色荧光，而混淆品不显示荧光。此方法准确、简便、快捷。

3.2 COI条形码DNA分子鉴定 王孟虎等[18]建立了东北、中国、恒仁、黑龙江林蛙的COI基因数据库，能有效区分不同地域林蛙，说明DNA分子鉴定技术是鉴定哈蟆油基原动物的新的方法。

4 小结与展望

综上所述，本文从传统的鉴别、仪器分析鉴别和分子生物学鉴别3个方面阐述了林蛙油鉴别方法的研究进展。可以看出中药材质量控制和真伪鉴别的技术方法越来越先进和完善。不同学科的相互补充和结合，加速中药鉴别的发展。传统的方法固然经典，但是新的技术更加的准确与快速。我们应该进一步探索和发现中药鉴别特征性甚至是专属性的物质，为中药的鉴定提供更好的方法。