非编码RNA在胆固醇代谢中的研究进展

李传伟 综述 曾春雨 审校

(1.陆军军医大学第三附属医院野战外科研究所心内科，重庆401220；2.重庆市心血管病研究所，重庆401220)

随着全球人口老龄化的到来，人类疾病构成发生显著改变，动脉粥样硬化性心血管疾病的发病率和死亡率逐年增加，动脉粥样硬化性心血管疾病逐渐成为全球死亡的首位病因。动脉粥样硬化性心血管疾病的病理基础是动脉粥样硬化，而高胆固醇血症是动脉粥样硬化最重要的危险因素之一。高胆固醇血症在动脉硬化的不同阶段均发挥了重要的作用，血流紊乱处内皮细胞脂质的沉积导致内皮细胞的受损，从而促进炎性细胞的黏附和浸润。而巨噬细胞在不断的摄取胆固醇脂质的过程中发生泡沫化并沉积在动脉粥样硬化斑块中使斑块体积不断的增大，促进了动脉粥样硬化病变的进展，而分泌的炎性因子则促进了斑块不稳定性增加而导致了急性冠脉综合征的发生[1]。

血清胆固醇水平受多种因素的综合影响，饮食习惯、遗传变异、激素水平、运动习惯、疾病状态、药物干预等多种因素均可影响血脂的水平，而胆固醇的水平受一系列调控基因的共同作用，以满足机体基本的生理需求(细胞膜组分及甾体类激素合成等)，又能避免器官过多的脂质沉积。近十几年的研究发现，非编码RNA在血脂水平的调控中发挥了重要的作用[2]。人类基因组计划发现人类仅有不到2%的基因编码了约2万种蛋白质，而其余的98%的基因不能编码蛋白质及多肽。非编码RNA根据分子量的大小可以简单分为长链非编码(lnc)RNA(>200 nt)和短链非编码RNA(<200 nt)[3]。短链非编码RNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)，miRNA通过与靶基因的3’非翻译区结合形成RNA诱导降解复合体而降解目标基因的mRNA发挥转录后调控的作用，大量的研究已经证实miRNA在脂代谢各个阶段均发挥了重要的调控作用[4]。与之形成鲜明对比的是lncRNA的研究还相对较少。lncRNA长度远大于miRNA，其分子结构复杂性远胜于miRNA。此外，目前已发现10万种以上的lncRNA，数量亦远胜于miRNA。另外，lncRNA的调控机制较miRNA更多样，近10年的研究证实lncRNA广泛参与机体多种生理和病理过程的调节，包括生长发育、造血过程、细胞增殖和凋亡、肿瘤发生、代谢、基因组印记、染色质修饰、病原体感染及免疫反应等过程[5-7]。非编码RNA与其调控的蛋白编码基因之间相互作用，形成高度复杂的RNA调控网络，lncRNA的突变或表达异常与许多疾病的发生密切相关。

1 miRNA对胆固醇代谢的调控

miRNA广泛参与了胆固醇的吸收、合成、转运、分解等众多生理过程，目前已经证实约10余种miRNA调控了胆固醇的代谢。大多数的miRNA由位于蛋白编码基因的内含子或基因间的非编码区域产生miRNA的前体pri-miRNA，然后于细胞质内经剪切加工成成熟的miRNA。pri-miRNA的转录受一系列转录因子的调控，而这些转录因子在调控miRNA转录的同时，亦可调控胆固醇代谢的相关基因。其中miR-33a/b位于固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)2和SREBP1之间。SREBP的前体以SCAP/SREBP2复合体的形式存在于细胞的内质网内，当细胞内胆固醇下降时，内质网上的SCAP/SREBP2复合体从Insig-1蛋白上解离，然后SREBP2在156位和158位赖氨酸残基处发生修饰和水解，SCAP/SREBP2复合体在向高尔基体转移的过程中逐渐从SCAP蛋白上解离，从而进入细胞核内转录一系列胆固醇合成相关基因的表达，如羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)受体等而促进胆固醇的合成，使LDL水平增加[8-9]。当SREBP被激活的同时，pri-miR-33亦被激活，使转录出的miR-33增加。miR-33进入细胞质后可以通过同胆固醇逆向转运的关键分子腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1，和腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1结合，通过下调腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1和腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1抑制了胆固醇的逆向转运，从而降低了高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的水平[10]。因此miRNA与邻近的基因可以从不同的方面共同调控胆固醇代谢相关基因的表达而发挥协同效应。此外，miRNA可以同时调控多个靶基因的表达，使不同的生理及病理反应发生相应的协同改变。如miR-33在调控胆固醇代谢相关基因的同时，还可以调控脂肪酸氧化的相关基因，如肉碱棕榈酰转移酶1A、羟酰基辅酶A脱氢酶、Sirtuin 6、AMP激酶α亚基及胰岛素代谢的相关基因，如胰岛素受体底物2，因此miR-33升高后的总效应是降低HDL、升高三酰甘油(triglyceride，TG)及加重胰岛素抵抗，这也可以部分的解释为何代谢综合征具有多种临床表现(中心性肥胖、高TG、高血压、高血糖及低HDL-C)，同时也解释了代谢综合征患者动脉粥样硬化风险的原因，因为这些临床表型是在共同的“土壤”中产生，而miRNA在其中扮演了“分子纽带”的作用。

由于mRNA与miRNA通过7个mer的碱基互补配对结合，因此基因3’非翻译区上可以结合多个miRNA，同一个胆固醇代谢相关的基因还可以受多个miRNA共同调控，如上述的腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1除受miR-33调控外，还同时受miR-148a、miR-758、miR-128-1、miR-130b、miR-27a/b、miR-10b、miR-144、miR-302a、miR-26及miR-301b等miRNAs调控[11-14]。这些miRNA与mRNA及相应的转录因子、信号传导分子间相互作用，共同形成一个复杂的调控网络，以维持机体内胆固醇的平衡。

2 脂蛋白内miRNA 的作用

miRNA除在细胞内调控胆固醇的代谢外，近十年的研究还发现外周血液循环中同样存在多种miRNA。循环miRNA通过与膜泡结构(微泡、外泌体、囊泡)或蛋白载体(Ago2、NPM1)结合稳定存在，避免被血液中广泛存在的RNA酶所降解。循环miRNA可以进入特定细胞胞浆内，并影响其靶基因mRNA的翻译效率，从而调控细胞功能。循环miRNA种类和含量的变化反应了疾病的状态，同时亦参与了疾病的进展。2011年，Vickers等[15]在《Nat Cell Biology》发表文章证实HDL是一种新的循环miRNA的蛋白载体，HDL内含有多种miRNA，此外LDL、极低密度脂蛋白(VLDL)内亦含有一定数量的miRNA，且种类及数量均有别于HDL。HDL通过携带miRNA参与了巨噬细胞与肝细胞间的通讯，此外HDL中所含miRNA的频谱与疾病状态是明显相关的，在家族性高胆固醇血症及肥胖患者中，miR-223的含量显著上升[15]。肝细胞通过清道夫受体-B1受体摄取HDL的同时，可以将HDL中携带的miR-223也一同转运进入肝细胞胞浆内，并影响了靶基因RhoB mRNA的翻译效率，从而调控肝细胞的相关功能，此外，HDL还可以将其中的miR-223转移至内皮细胞，从而抑制细胞间黏附因子1的表达，影响内皮细胞炎症因子的释放而发挥抗炎的效应[16]。与此同时，miR-223进入肝脏细胞后，还可以通过抑制清道夫受体-B1的表达而调控肝脏对HDL的摄取，同时还可通过抑制3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1的活性而抑制肝脏胆固醇的合成[17]。脂蛋白能携带miRNA与其特殊的结构相关，LDL主要由载脂蛋白apoB100、胆固醇等构成，而HDL则由载脂蛋白apoAI、胆固醇及TG等构成。两者均为球形大分子，分子结构非常相似。脂蛋白中分子极性排列，形成外层亲水，内层亲脂的双层结构，类似于脂质体，因此可以作为内源性核酸类物质的天然载体[18]。因此，脂蛋白除本身作为胆固醇的载体外，还可以通过内部的miRNA参与了多种生理过程的调节，这也部分解释了HDL除具有胆固醇逆向转运的功能外，还能发挥抗炎症、抗氧化、抑制血小板活化、保护内皮功能等作用。

3 lncRNA对胆固醇代谢的调控

与miRNA相比，虽然lncRNA数量众多，目前lncRNA调控胆固醇代谢的研究还相对较少，而已经揭示其调控分子机制的lncRNA数量更是凤毛麟角，这与lncRNA的本身分子结构和人们以往的研究不足相关。首先，与mRNA和miRNA不同，lncRNA的表达和分布呈高度的种属、组织、细胞和发育阶段的特异性，人类的lncRNA中仅有不到20%的lncRNA可以在常见的模式动物上寻找到同源序列，使得其在动物上的过表达或敲除的功能研究陷入了困境。而其组织特异性的表达，大部分的lncRNA主要在睾丸组织中呈高表达，而在常见的易取材的组织中却呈低表达，使得其在体研究较难开展。而其发育阶段的特异性使得有的lncRNA仅在胚胎发育的特定阶段发挥作用，如lncRNA XIST介导的X染色体失活，若在常见的肿瘤细胞系中很难复制到同样的过程[19]。其次，lncRNA的分子量要远高于miRNA，其三维分子结构不能简单的通过碱基的组成而得到推算。而lncRNA作用的靶基因亦不能简单的通过碱基互补而预测，同一个lncRNA，其5’端和3’端可结合不同的蛋白和基因，发挥不同的调控作用。最后，lncRNA本身的调控机制复杂，已经被证实的机制包括：转录抑制、染色质重构和组蛋白修饰、RNA剪切、内源性siRNA、分子伴侣、小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前体分子、miRNA的分子“海绵”等多种机制在细胞核内或细胞质中，顺式或反式调控靶基因的表达[20-21]。

既往的一些研究显示lncRNA在血脂调节中发挥重要的作用，如：小鼠肝脏特异性表达的lnc-LSTR可以同TDP-43形成蛋白复合体来调控胆酸合成通路关键基因Cyp8b1的表达，并进而通过FXR核受体而影响载脂蛋白apoC2的表达从而调控肝脏TG的代谢[22]。而APOA1基因反义链上的lncRNA APOA1-AS则可以通过与组蛋白修饰蛋白复合体中的LSD1及EZH2蛋白亚基结合改变染色体组蛋白甲基化而调控正义链上APOA1的表达[23]。大鼠肝脏内lnc-HC可以与hnRNPA2b1结合从而调控下游腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1及CYP7A1的表达而负向调节胆固醇的水平[24]。lncRNA LeXis 可以与转录辅助因子RALY结合，从而抑制胆固醇合成关键基因SREBP2、HMGCS、FDFT1、CYP51等基因的表达，从而降低肝脏胆固醇合成及血清胆固醇水平。同时lncRNA LeXis的转录受胆固醇代谢关键转录因子肝脏X受体的调控，从而形成复杂的调控网络[25]。在巨噬细胞泡沫化过程中，氧化LDL诱导lincRNA-DYNLRB2-2表达增加，并通过GPR119而升高腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1的表达而促进胆固醇的逆向转运和抑制炎症反应[26]。而同样在巨噬细胞泡沫化过程中，RP5-833A20.1通过升高miR-382-5p的表达而抑制核因子 IA表达，从而调控了细胞内胆固醇的逆向转运及炎症因子的表达[27]。

4 非编码RNA作为调脂治疗靶点的转化研究

目前对于冠心病等动脉粥样硬化的高危人群，国内外调脂治疗指南均推荐高强度的他汀类药物或强化他汀类药物治疗以进一步降低心血管事件的残余风险，但是他汀类药物剂量翻倍的同时，其降低LDL-C的幅度仅增加6%，即他汀类药物的“6%的原则”。此外，高强度的他汀类药物治疗带来肝脏损害、横纹肌溶解等并发症的发生率成倍增加。因此，联合其他类型的调脂药物治疗方案成为进一步降低胆固醇水平的新的治疗方向。鉴于非编码RNA在脂代谢中的重要调控作用，针对miRNA、lncRNA的转化研究亦已开始进入临床前研究。

由于常用的啮齿类动物缺乏胆固醇酯转移蛋白表达等原因，大小鼠血脂谱表现为高HDL和低LDL，与人类血脂谱相反，故啮齿类动物常规高脂喂养较难诱导出动脉粥样硬化斑块。因此，针对miRNA干预的临床前研究最佳的模型应为非人灵长类。Rayner等[28]发现给予非洲绿猴针对miR-33a和miR-33b的寡核苷酸后，全身miR-33a和miR-33b的表达明显降低，与此同时，肝脏腺苷三磷酸结合盒式转运因子A1表达升高，HDL-C水平明显升高并持续12周以上，HDL介导的胆固醇逆向转运亦增加，说明抑制miR-33不仅增加了HDL-C的量，还增强了HDL的功能。同时，给予寡核苷酸后，肝酶、肌酶、胆红素、肌酐等并没有明显的改变，说明寡核苷酸介导的miRNA干扰短期是安全的。目前尚无专门的针对高脂血症的miRNA临床研究，但已有miRNA干扰或过表达治疗慢性丙型病毒性肝炎等疾病临床研究正在进行。RG-101是N-乙酰半乳糖胺结合的抑制miR-122表达的寡核苷酸，在Ⅰ期临床试验中(EudraCT临床试验注册号2013-002978-49)，在一次给予2 mg/kg或4 mg/kg的RG-101治疗4周后，血清中丙肝病毒量分别下降4.42 log10IU/mL 及5.07 log10IU/mL,甚至有部分治疗组病例在76周后血清中病毒量低于了检测范围。由于miR-122在肝脏胆固醇的代谢中发挥了重要的调控作用，在RG-101组可观察到总胆固醇有0.9～1.4 mmol/L的降低，此外LDL-C、TG及HDL-C均有不同程度的下降，因此以miR-122作为靶点亦可发挥调脂的治疗效应[29]。Miravirsen是锁核酸硫代磷酸DNA修饰的miR-122的反义核苷酸，在miravirsen的Ⅱa期临床试验中，miravirsen亦表现出强大的抑制丙型肝炎病毒复制的能力，因此miravirsen将有可能成为第一个被美国食品药品监督局批准上市的miRNA类的药物[30]。

除抑制miRNA的表达外，还可以通过过表达miRNA发挥调脂效应，但与抑制miRNA相比，过表达miRNA需要克服的巨大的技术难题在于如何完整的将miRNA的mimic转移到靶细胞的细胞膜内而不被RNA酶所降解。在系统性给予的过程中，需要借助质粒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脂质体、纳米颗粒等载体进行转染。Mirna Therapeutics公司开发的miR-Rx34是第一个进入Ⅰ期临床试验的以脂质体为载体过表达miRNA以针对原发性肝癌及其他实体肿瘤的药物，在给予miR-Rx34后，尽管肿瘤组织内miR-34a水平明显升高，但有5例志愿者在研究过程中发生了严重的免疫相关不良反应，因而于2016年9月终止进一步试验。此外，生物载体(腺病毒、腺相关病毒、慢病毒)由于其安全性及伦理问题，目前也仅限于实验室研究，要进入人体试验尚有许多问题需要解决。而HDL作为内源性的miRNA的载体，与上述的载体相比有许多的优势。首先，HDL作为人体本身存在并大量表达的天然蛋白，可由患者自身提取并回输入体内，其生物安全性要明显高于生物载体。其次，HDL代谢的相关途径及受体已研究得非常透彻，HDL可以通过受体被肝脏所摄取，其次其最理想的靶器官主要为肝脏。最后，HDL在体内的代谢时间为数天，较其他载体相比其体内存留时间较短，不必担心病毒长期感染的问题。尽管如此，以HDL作为载体还有一些关键问题需要解决。首先，天然的HDL携带的miRNA量有限，一旦被消耗需持续的补充。其次，同一个miRNA可干扰不同的基因，其功能多样性很难达到分子特异性干预的目的。另外，不同脂蛋白之间存在脂质的交换，其所携带的miRNA是否也发生了交换，目前尚不清楚。 最后，HDL携带miRNA后亦有可能改变分子结构，导致免疫反应和炎症的激活。目前由于lncRNA调控脂代谢的研究还处于起步阶段，更多的还集中在基础研究，很多lncRNA的机制还不清楚，因此针对lncRNA的临床研究尚未开展。

5 结论及展望

以miRNA及lncRNA为代表的非编码RNA是脂代谢重要的调控分子，非编码RNA在胆固醇的消化、吸收、合成、转运及分解等各个阶段均发挥了重要的作用。不断的基础及临床研究不但能够揭示非编码RNA在脂代谢中的分子机制，而且有望发现新一代降脂药物的作用靶点。如何加快基础研究结果的转化，成为造福众多患者的利器，将是今后基础研究者及临床工作者的重点关注方向。