直肠癌化疗对5-氟尿嘧啶耐药者二氢嘧啶脱氢酶基因表达水平及突变的影响*

赵雪晴，李　全，钱世宁，李鹏飞△

(1.江苏省南京市妇幼保健医院　210029；2.江苏省中医院，南京 210029)

抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)是肿瘤患者化疗药物中普遍使用的。但是，5-FU在患者身上的疗效及毒性有显著差异，尤其是在毒性方面不同个体差异较大，严重情况会出现致死性的腹泻、骨髓抑制等[1-2]。机体内的5-FU有80%～85%经过肝脏的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)代谢成为无活性成分排出体外[2]。研究表明5-FU的不良反应与其代谢和清除的限速酶DPD活性密切相关[3]。随着分子诊断技术的迅速发展，对参与5-FU分解代谢的DPD编码基因的重要位点进行测序，寻找出能够指导临床化疗的关键突变，为5-FU个体化用药提供科学依据。本研究拟检测使用5-FU化疗的患者外周血单个核细胞DPD基因表达水平及突变情况，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2015年2月至2016年6月在江苏省中医院肿瘤科住院的50例直肠癌患者，经病理证实为结直肠癌，治疗均使用5-FU，其中化疗敏感组22例，男14例、女8例，中位年龄63.2岁；化疗耐药组28例，男18例、女10例，中位年龄62.1岁。两组患者的年龄和性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有受试者均签署临床试验知情同意书。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞分离按照说明书采用Ficoll分离液分离所有患者外周血单个核细胞。

1.2.2实时定量PCR检测DPD mRNA的表达采用Trizol 法提取总RNA，使用Eppendorf核酸蛋白检测仪测定RNA水平，随后反转录成cDNA。mRNA反转录反应体系(20 μL):5×PrimescriptTM缓冲液4 μL，PrimescriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 4 μL，RNase Free H2O 10 μL。反转录反应条件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。使用TaKaRa公司荧光定量检测试剂盒，按照试剂说明书进行实时定量PCR。PCR反应体系(20 μL):2×SYBR green 染料10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL。反应条件:95℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，扩增40个循环；在延伸步骤中采集荧光信号。DPD上游引物(5′-3′)：AGG ACG CAA GGA GGG TTT G，下游引物(5′-3′)：GTC CGC CGA GTC CTT ACT GA。使用美国ABI7500实时荧光定量PCR仪进行扩增。结果分析用SDS software version 2.0，分析条件设置:根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值及Threshold的value值，在analysis菜单下选择analyze自动分析结果。β-actin作为内参，采用相对定量法(2-ΔΔCT)计算DPD mRNA的相对表达量。

1.2.3测序法检测DPD突变检测化疗耐药组28例患者外周血单个核细胞中DPD突变情况。

1.2.3.1DNA制备加入600 μL核裂解缓冲液重新悬浮细胞。加入40 μL 10%SDS，混匀。再加入10 μL 20 mg/mL的Proteinase K，5 μL 10 mg/mL的RNase A，混匀，50 ℃水浴过夜。加入200 μL 5.3 mol/L 的NaCl 溶液，混匀，13 000 r/min 4 ℃条件下离心30 min。转移上清液到另一管中，加一倍体积4 ℃预冷的异丙醇，充分混匀。可见絮状DNA 析出。13 000 r/min 4 ℃条件下离心15 min，弃上清液。用75%的乙醇洗涤沉淀2 次，弃上清液，室温晾干。加入适量TE 溶液溶解沉淀，-20 ℃长期保存备用。

1.2.3.2PCR及测序采用中山达安有限公司DPD点突变检测试剂盒。以影响DPD活性较大的点突变为靶区域，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合测序技术，检测对DPD活性影响较大的A74G、T85C、A1627G、T1896C、IVS14+1G>A、14G1A、G2194A点突变。PCR反应体系如下：BigDye 1.5 μL，Primer 5 pmol，DNA 40～80 ng，H2O至10 μL。采用ABI 7500实时定量PCR仪。反应条件如下：96 ℃ 2 min，96 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 50 min，72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR反应产物的纯化:每个样品加入31 μL 乙酸铵(30 μL 95% 乙醇，1 μL 醋酸铵)，充分振荡混匀；15 ℃，4 000 r/min离心45 min；将样品倒置，下面垫上吸水纸，放入离心机倒甩，转速不要超过300 r/min；每个样品再加入50 μL 75%乙醇；15 ℃，4 000 r/min，离心25 min；将样品倒置，下面垫上吸水纸，放入离心机倒甩，转速不要超过300 r/min； 避光晾干(约30 min)，每个样品加入3 μL 上样缓冲液。

2　结　　果

2.1各组DPD基因表达水平实时定量PCR结果表明，所有患者外周血单个核细胞中均可检测到DPD mRNA的表达。化疗耐药组DPD mRNA相对表达水平为0.093±0.020，化疗敏感组DPD mRNA相对表达水平为0.058±0.010，化疗敏感组DPD mRNA水平明显低于化疗耐药组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2DPD基因突变情况5-FU治疗敏感及耐药患者外周血单个核细胞中均未检测到DPD突变位点。

3　讨　　论

5-FU是一种治疗癌症的嘧啶类似物的药物，是用于治疗直肠癌的有效方案[4-6]。但有研究表明，DPD的活性可能会导致5-FU的药理性质变异[7-8]。DPD是5-FU分解、代谢和清除的限速酶，DPD活性降低或缺乏与5-FU的降解速度下降呈正相关，因此在治疗使用5-FU引发严重的不良反应时，DPD活性越低对5-FU的不良反应程度越高[9]。

众多研究表明DPD表达水平与5-FU的化疗疗效密切相关，DPD表达水平越高，化疗效果越差[10]。本研究发现采用5-FU化疗的患者中化疗敏感组DPD mRNA表达水平较化疗耐药组低且差异有统计学意义(P<0.05)，因此临床上在化疗前对DPD水平进行测量，可减少和避免不良反应的存在，更利于临床进行个体化治疗。

同时有研究表明个体DPD活性差异与DPD基因某些位点的遗传多态性相关[11]。有学者对1例化疗后出现严重5-FU毒性致死女性的DPD23个外显子进行测序，结果发现1个新的DPD基因位点T464A等位基因发生频率约为0.2%[12]。同时有学者验证15种已知的DPD基因序列，新发现3种:G1218A、C3067T和G1236A，但发生频率很低[13]。临床和实验研究已经表明DPD活性下降与DPD基因多态性相关[14]。国内目前对此研究较少，因控制DPD多态性活性的分子机制较为复杂，许多化疗后出现严重毒性者并未检测到DPD基因突变[15]。本次试验选取几个已报道的突变位点进行检测，对5-FU耐药的患者检测也暂未发现DPD基因突变现象。通过实时定量PCR进行扩增及测序，测定DPD基因位点突变情况。本研究发现5-FU治疗敏感及耐药患者均未检测到突变，与国内学者报道的结果相同[16-18]。

总的来说，DPD的基因表达水平与化疗敏感性相关。相信随着人们对DPD研究的深入，新的DPD突变位点的发现将有助于预测5-FU应用者的毒性风险和疗效，可能成为指导临床个体化治疗的重要参考指标。