核桃叶斑病病菌菌丝体及孢子越冬存活研究

刘金宇，迪丽努尔，贾海英，蒋萍

(新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】核桃(Juglansregia)为胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)，属多年生落叶果树，具有良好的经济价值和社会效益。新疆南疆气候光热资源充足，降雨量少，昼夜温差大等独特的气候条件，为核桃的生长提供有利条件，核桃已成为新疆主要发展的果树树种之一。自2000年至今，新疆核桃产量呈现逐年增长趋势，15 年间核桃总产量增加了 43.3 倍[1]。其中南疆地区和田、阿克苏、喀什为核桃主产区，占新疆总产量的98.58%，截至2015 年底，南疆核桃的栽种面积已达到34.0×104hm2，挂果面积达28.24×104hm2，年总产量为58.04×104t[2]。随着核桃种植面积的不断扩大、大面积栽培同一品种、实际生产中缺乏栽培管理经验等问题的出现，核桃病害也随之增多。其中2010年在和田墨玉县托乎拉乡发现的核桃叶斑病是主要病害之一[3]，该病害呈现逐年加重并向外蔓延的趋势，严重时发病率达100%。叶缘焦枯及大面积坏死影响核桃果实的正常生长发育，造成果实品质下降，制约了南疆果农的增收致富。【前人研究进展】韩敏等[4]明确了病原菌种类并筛选出了防治药剂；丁俊杰等[5]调查了发病影响因子；王杰等对病害发生动态(待发表)进行了监测调查。【本研究切入点】越冬是侵染循环的一个重要且薄弱的环节，链格孢属真菌在越冬期间处于休眠状态，且潜伏场所比较固定，易于控制、消灭，掌握这个环节常常是病害防治的关键所在。新疆核桃链格孢叶斑病病原菌的越冬存活情况还未见报道。研究核桃叶斑病病原菌的越冬方式及场所。【拟解决的关键问题】连续两年定期从田间采回疑似病原菌的越冬器官组织，采用组织分离法及固体平板稀释涂布培养计数法来探明该病害病菌的越冬方式及场所，为核桃叶斑病的监测预报提供理论依据，实现对该病害的有效控制。

1 材料与方法

1.1 材 料

2016年11月～2017年2月、2017年11月～2018年2月，连续两年在病害发生严重的和田市洛浦县多鲁乡、恰尔巴格乡、山普鲁镇、杭桂乡、洛浦镇五个乡镇的核桃园内采样。

采用五点取样法分别在各园随机抽取10棵树，每月从每棵树下冠层东西南北四个方向采集树上病叶及地上落叶(带有典型病斑但无霉点)、果实、主干树皮、一年生侧枝及其芽，装入无菌纸袋，做好标记带回实验室。表1

1.2 方 法

1.2.1 病原菌菌丝体在不同越冬部位分离培养

用清水冲洗干净从每园取回的越冬组织后，放在无菌纸上晾干，从病叶的病健交界处剪取50个(0.5×0.5) cm的病组织块，而主干树皮、侧枝、果实上未见明显病斑，各处理随机切取50个组织块，每园随机抽取50颗芽。用5%的NaClO消毒，用无菌水冲洗3次，每次1 min，在滤纸上吸干水分后移至马铃薯蔗糖琼脂培养基上，每皿5块，各处理共10个皿，做好标记后置于25℃恒温培养，分别于3、5、8 d观察病原菌在各越冬组织上生长的情况[6]，记录病原菌菌落数量，根据公式(1)计算病菌的分离率，根据分离率的大小来确定病原菌菌丝体的主要越冬场所。

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表1 样本采集数量Table 1 Sample collection

器官组织Organ tissue多鲁多Duolu恰尔巴格乡Qiaerbage山普鲁镇Shanpulu洛浦镇Luopu杭桂乡Hanggui树上病叶 (片) Hanging on the tree4040404040病落叶 (片) Fallen on the ground4040404040芽 (颗) Bud5050505050一年生侧枝 (根) Annual branch1010101010主干树皮 (块) Trunk bark5050505050果实 (个) Fruit1010101010

1.2.2 测定病菌孢子在不同生境越冬病残体上存活率

2016、2017年在多鲁乡、恰尔巴格乡、山普鲁镇三个乡镇的核桃园内分别收集密生大量病菌孢子的叶片，分装在7个网兜中，于当年10月下旬分别挂在树上、置于地表、埋入5、10、15、20、30 cm的土壤中，翌年2月底取回。

采用固体平板稀释涂布培养计数法[6]。用无菌水冲洗掉病叶上的杂土、晾干，剪取带有霉点的病斑组织，放入无菌水中制成孢子悬浮液，浓度调至低倍镜下每个视野内的孢子数在10个左右，吸取1 mL加入到9 mL无菌水的试管中，配制成10-1的浓度，重复上述步骤，制成10-2的孢悬液。吸取0.1 mL孢悬液均匀涂布到带有乳酸的PSA培养基表面[6]，每梯度浓度重复3次。做好标记后倒置于25℃恒温培养，分别于3、5、8 d观察病原菌孢子的生长情况，记录每处理目标菌菌落数量，根据公式(2)计算不同生境下病原菌分生孢子的存活率。

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1.2.3 土壤中病原菌分离

2018年2月底在多鲁乡、恰尔巴格乡、山普鲁镇三个乡镇的核桃园内采用五点取样法每园随机抽取两棵核桃树，分别在树冠下距离主干50 cm处，挖取0、2、5、10、15、20和30 cm七个土层的土样各20 g，装入无菌自封袋中，做好标记带回实验室。

采用干燥法测定土壤样品水分[7]，采用固体平板稀释涂布培养计数法测定不同深度土壤中病原菌数量。取5 g干燥后的土壤于三角瓶中，加入45 mL无菌水充分振荡摇晃10 min，制成土壤悬液。浓度梯度的配制同1.2.2，每梯度浓度重复3次。做好标记后倒置于25℃恒温培养，分别于3、5、8 d观察记录培养基中的菌落数量，根据公式(3)确定病原菌在不同土层深度的分离率。

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2 结果与分析

2.1 病原菌菌丝体在不同越冬部位的分离结果

研究表明，每月均能从六种器官组织上分离出链格孢菌。从不同器官组织来看，病落叶、树上病叶病原菌的分离率最高，均高达90%以上，其次是在侧枝上的芽及主干树皮，而一年生侧枝及果实携带病原菌菌量最少，平均分离率为65.18%、62.58%，二者不是该病菌的主要越冬场所。图1

从2016～2017年不同月份分离的结果来看，2016年病菌分离率由小到大为12月>2月>11月>1月，2017年病菌分离率为11月>2月>1月>12月，两年的结果存在一定差异。从两年对六种器官四次取样分离的总结果来看，树上病叶、病落叶及果实上病菌的分离率基本上呈现随着越冬时间的延长，病原菌的总量逐渐增加的规律，而其他器官上越冬病菌数量变化趋势不一致。

方差分析结果表明，在不同的器官组织上越冬病菌的数量之间存在一定差异，树上病叶、病落叶、芽、主干树皮上病菌越冬数量两年之间均无显著性差异(P>0.05)，果实和一年生侧枝之间也如此。不同在于一年生侧枝2016年的病菌数量与树上病叶、病落叶之间有显著差异(P<0.05)，而2017年除了与树上病叶、病落叶之间有显著性差异外，还与芽、主干树皮有显著性差异(P<0.05)。同一越冬部位不同时间的越冬病菌数量无显著性差异(P>0.05)。由此推断越冬病原菌存活数量的变化与月份无关，与器官组织的类型有关。图2

2.2 病残体上的病菌孢子在不同生境的越冬存活

研究表明，2016、2017年病残体上的病菌孢子越冬存活数量规律基本一致。在地下5、10、15和20 cm深度越冬病残体上的病菌孢子存活率要高于地表与树上的，15 cm处越冬的病菌孢子存活率最高，两年存活率分别为41.5%、35.64%。从地表到土下15 cm病菌孢子存活数量不断增多，之后数量减少，20 cm处比15 cm分别减少了21.81%、13.04%，而30 cm土层中病菌孢子存活率明显低于其他处理，平均存活数量仅为2.78%。

地下10与15 cm处病菌孢子存活率两年均无显著性差异，但15 cm与其他几种生境都存在显著性差异(P<0.05)。2016年树上病叶和病落叶、土层30 cm处孢子存活率均无显著性差异(P>0.05)，2017年结果显示只有树上病叶与土层30 cm处的孢子存活率无显著差异(P>0.05)，但是病落叶上的孢子存活率要高于树上病叶与30 cm土层。图3

图1 在核桃不同部位上越冬的病原菌分离率

Fig.1 The isolation rate of pathogens in different sites of walnut

图2 两年不同月份病菌越冬分离率

Fig.2 Overwintering separation rate of pathogens in different months of two years

图3 不同生境病残体上病菌孢子存活情况

Fig.3 Survival of pathogen spores in different habitats

2.3 土壤中病原菌的分离结果

研究表明，在地表土中分离到链格孢菌的比例最高，10-1浓度分离率为70.33%，10-2分离率为35.97%，随着土层的加深，分离到病菌的比例逐渐降低，地表到土层2 cm处的病原菌数量下降幅度最大，平均下降了38.66%，而2 cm土层到20 cm之间病菌分离率从14.50%降到0.86%，下降幅度相对较小， 20 cm 10-1浓度病原菌分离率1.72%，10-2未分离到病原菌。

方差分析结果表明，在两个浓度下，地表土与其他土层深度中病菌数量均存在显著性差异(P<0.05)，在 10-1浓度下，土层2 cm处的病原菌数量和20 cm处的存在显著差异(P<0.05)，但在10-2浓度下，土层内各深度链格孢菌的数量均无显著差异(P>0.05)。图4，图5

图4 不同土壤深度病原菌分离率

Fig.4 Separation rate of pathogens at different soil depths

注: A:核桃树整体受害症状; B:核桃小叶受害症状; C:带霉点病叶; D:同心轮纹型病斑; E:带紫边型病斑; F:树上病叶的分离培养; G:芽的分离培养; H:果实的分离培养; I:一年生侧枝的分离培养; J:主干树皮的分离培养; K:落叶的分离培养; L:土层5cm病残体的分离培养; M: 土壤15 cm 处病原菌分离培养; N:病原物的纯化培养

Note: A:walnut tree overall damage symptoms; B:walnut leaf damage symptoms; C:moldy diseased leaf; D:concentric wheel-shaped lesions; E:purple-edged lesions; F:separation culture of diseased leaves on tree; G:separation culture of buds; H:separation culture of fruits; I:separation culture of annual collaterals; J:separation culture of trunk bark; K:separation and cultivation of dropped leaves; L:separation culture of plant residues buried the underground of 5cm; M:separation culture of pathogenic bacteria at 15 cm of soil; N:purification culture of pathogens

图5 核桃叶斑病病叶症状及病原分离物在PSA平板上的菌落形态

Fig.5 Leaf symptoms of walnut leaf spot disease and colony morphology of pathogen isolates on PSA plates

3 讨 论

病原物越冬方式有很多，营养体、各种孢子、子实体、菌核、菌索等都可以在一定条件下度过不良环境[8]，越冬场所也因病原、发病部位等不同而有所差异。此次研究结果与链格孢菌引起的叶部病害结果一致[9-10]，带病落叶是许多叶部病害病原物的主要越冬场所。朱克恭[11]对银杏叶枯病研究得出，链格孢菌能够在落叶上长期存活，并占绝对优势，王金友等[12]也认为苹果斑点落叶病病菌在落叶上的生存比例要高于其他部位。此次研究表明芽的病菌分离率仅次于病叶，是主要越冬场所之一，这一结论与多数病害一致[12-14]。而主干树皮四个月分离率不稳定，无明显规律，平均分离率为79.58%，是仅次于芽的越冬场所，这一结果与枣果黑斑病相似，主干树皮为主要的越冬场所[15-16]。

目前在相关文献中还没有研究对随着越冬时间的延长，病菌的存活变化情况进行分析，但多数人的研究结果显示，病叶上的病菌在越冬期间分离率较稳定，且基本上呈现逐渐增多的趋势，如油松枯梢病[17]、脐橙炭疽病[18]以及川麦冬炭疽病[19]。一年生侧枝的分离结果与枣果黑斑病的相似[16]，在前3个月的分离中病原菌数量逐渐减少，但最后一次分离率有所升高，但与油松枯梢病、脐橙炭疽病对枝上的病菌分离结果相反。核桃叶斑病菌在果实上的越冬变化规律与病叶上的基本一致，这一结果与枣果黑斑病在果实上越冬的情况恰好相反。

以病原菌的分离率来掌握越冬场所只能定性分析各越冬器官组织上是否存在越冬的病原菌，但是不能定量分析各器官组织上越冬病菌的数量。由于试验中分离到的菌落有目标菌纯菌落和混生菌落，对于混生菌落来说，仅统计病菌分离率不能全面反映目标菌的数量。有必要探索实验方法来定量统计混生菌落中目标菌的数量，使研究结果更能接近实际。

水稻叶尖枯病[20]研究认为土下病残体上病菌存活率高于土表，研究结果与其一致。万寿菊链格孢叶斑病[21]、甘草叶斑病[22]的研究表明，病菌孢子在不同深度及地表的病残体上均能越冬并成为第二年的初侵染源，而且在地下相对较深的位置越冬的病菌的存活率较高，研究结果与上述结果基本一致。而龙亚琴[23]对金刚藤叶斑病越冬病菌菌丝体的研究结果认为，埋于土下10、20 cm的病菌存活率较土上部分低，且地下相对越深的位置越冬的病菌数量越少。产生这一差异的原因可能与菌丝体和分生孢子对环境的适应性不同有关。

黄红兰等[18]在脐橙炭疽病中取地表土分离培养、王治江等[24]在带有胡萝卜斑枯病的园子中对越冬耕作层的土壤稀释分离、张文梅等[25]在对蜜桔黑斑病的越冬场所进行调查，研究结果与上述研究基本一致，表明病原菌也能在土壤中越冬。以上研究未设置土层深度处理，仅定性的调查土壤中是否存在病原菌，而此次研究定量分析了各土壤深度中病原菌存活数量及变化规律。

确定病原菌的越冬方式及场所对病害控制有重要的指导意义，病原菌在田间存活，翌年遇到良好的环境条件就会萌发侵染植物，导致病害的流行[26]。冬春季节应及时清除树上及地表的病残体，及时修剪病枝，并在越冬前后为土壤打药，或者深翻土壤，可有效降低病原菌越冬基数，减少初侵染源，控制核桃叶斑病的扩展蔓延。

4 结 论

4.1 核桃叶斑病病菌能够以菌丝体在病株各部位越冬，主要的越冬场所是树上残留及落在地表的病叶，分离率高达90%，其次是芽和主干树皮，分离率为87.67%、79.58%，而一年生侧枝及果实上分离到的病原菌均不足70%。方差分析结果表明，树上病叶、病落叶、芽及主干树皮之间无显著差异(P>0.05)，菌丝体数量显著高于一年生侧枝及果实，病原菌菌丝体数量的变化与越冬部位有关，与取样分离时间无关。

4.2 病原菌能够以分生孢子随着病残体在土壤内及地上部分安全越冬，在土层内病残体上越冬的孢子数量要高于地上部分的，10～15 cm处病菌孢子存活量最高，两年平均存活率为38.57%，之后随着深度增加而减少，病菌在30 cm土层处仅有2.78%的存活数量。方差分析结果表明，10～15 cm的孢子数量与其余生境中的存在显著性差异(P<0.05)。

4.3 病原菌能够在0～20 cm土壤中越冬，但随着土壤深度增加病原菌逐渐减少，地表越冬病菌数量最多，平均分离率为53.15%，而20 cm土层处仅分离到0.86%的病原菌，且地表土与土壤各处理中的病菌数量存在显著性差异(P<0.05)。