长三角地区果蔬灰霉病病菌对5种杀菌剂的抗药性检测

卢晓雪， 聂国嫒， 孙海燕， 张金凤， 陈怀谷， 魏利辉

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014)

果蔬灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的真菌病害，目前已经成为一种全球范围的真菌病害。灰葡萄孢寄主范围广，可以侵染多种蔬菜、果树以及其他经济作物，一旦发病就会给农业生产造成重大危害[1]。灰霉病的防治一直是一个重要问题，目前生产上主要以化学防治为主，化学防治主要有苯胺基嘧啶类嘧霉胺、苯并咪唑类多菌灵、二甲酰亚胺类腐霉利等[1-2]。灰霉病病菌具有寄主范围广、遗传变异快等特点，且由于连续长期单一使用化学药剂，灰霉病病菌已经对上述药剂产生抗药性，这在国内外多个地区的多种作物上均有报道[3-4]。已有研究表明，江苏、浙江以及安徽等地区草莓、黄瓜、番茄等寄主上的灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利等传统杀菌剂产生了较高的抗药性[5-7]。

咯菌腈和啶酰菌胺是生产上登记防治灰霉病病菌效果较好的新型杀菌剂，其中咯菌腈最初于2009年在我国登记使用，用于防治菊花灰霉病[1]，目前关于灰霉病病菌对咯菌腈产生抗药性的报道较少[8]。啶酰菌胺是属于新型烟碱类杀菌剂，在21世纪初引入我国，用于防治黄瓜灰霉病，对灰霉病病菌具有较好的防治效果[9-10]。但在国内外不同地区，已有关于灰霉病病菌对啶酰菌胺产生抗药性的报道，2010年Avenot等报道了啶酰菌胺的田间抗性菌株[11]，2012年余玲等在山西省发现了对啶酰菌胺产生抗性的菌株[12]。

由于灰霉病病菌的抗药性在生产上造成的一系列问题[13-14]，同时为了综合评价长三角地区果蔬灰霉病病菌对传统型杀菌剂和新型杀菌剂的抗药性现状，笔者从我国江苏、浙江、上海等9个地区，在番茄、草莓、莴苣等6种果蔬产区采集灰霉病病样，采用最低浓度抑制法检测灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺等的抗药性，以期为不同地区不同作物灰霉病的田间用药和化学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株的采集与纯化

2013—2014年，在盐城、淮安、镇江、扬州、南通、苏州、上海、嘉善、宁波等9个地区的塑料大棚内，采集来自草莓、黄瓜、番茄、莴苣、瓠瓜、西瓜等6种果蔬作物的病叶或病果，病叶或病果放于自封袋中带回实验室，在无菌条件下，经过分离纯化共得到210个灰葡萄孢单孢株系，转移至马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，简称PDA)培养基斜面上，保存于 4 ℃ 冰箱中备用。菌株的详细信息如表1所示。

表1 待测灰霉病病菌菌株信息

1.2 供试药剂

95%嘧霉胺原药，购自江苏丰登农药有限公司；98%多菌灵原药，购自江苏省江阴凯江农化有限公司；98%腐霉利原药，购自江西禾益化工股份有限公司；96%咯菌腈原药，购自江苏省无锡路浩化工有限公司；98%啶酰菌胺原药，购自河北美星化工有限公司。

98%多菌灵原药用0.1 mol/L HCl溶液溶解成 1 000 μg/mL 母液，其他原药均用少量丙酮溶解配制成 1 000 μg/mL 母液，均贮存于4 ℃冰箱待用。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯洗净去皮，称取200 g切成小块，加水煮烂，用纱布过滤，加入15 g琼脂，10 g葡萄糖，补足 1 000 mL 去离子水。PDA培养基用于灰霉病病菌的分离、菌株保存以及灰霉病病菌对多菌灵、腐霉利、咯菌腈的抗药性测定。根据Chapeland等的方法[4]配制培养基用于灰霉病病菌对嘧霉胺的抗药性测定，培养基配方：10.0 g葡萄糖，1.5 g磷酸氢二钾，2.0 g磷酸二氢钾，1.0 g硫酸铵，0.5 g硫酸镁，16.0 g 琼脂，1 000 mL去离子水。水琼脂培养基：15 g琼脂，1 000 mL 去离子水。水琼脂培养基用于灰霉病病菌对啶酰菌胺的抗药性测定。上述3种培养基均于121 ℃高压湿热灭菌20 min，冷却后贮藏备用。

1.4 果蔬灰霉病病菌对5种杀菌剂的抗药性测定

采用最低浓度抑制法，嘧霉胺、多菌灵、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺分别以1.0、1.0、5.0、0.5、5.0 μg/mL作为鉴别浓度，并以此制备含药平板。

灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利、咯菌腈的抗药性检测方法：将待检测的灰霉病病菌菌株接入PDA培养基平板上，于25 ℃黑暗培养96 h后，取直径为5 mm的菌片至各含药培养基平板中，以无药平板为对照，每个处理3次重复，25 ℃ 黑暗培养72 h后观察菌株生长情况，与不含药的培养基平板相比，不能或几乎不能在该浓度的含药培养基平板上正常生长的菌株为敏感菌株，能正常生长的菌株为抗性菌株。

灰霉病病菌对啶酰菌胺的抗药性检测方法：参照潘金菊等的方法[15]，检测啶酰菌胺对灰霉病病菌孢子萌发的影响。将待检测的灰霉病病菌菌株接入PDA培养基平板上，于 25 ℃ 黑暗培养5 d至菌丝长满平板后，黑光灯诱导灰霉病病菌产孢，在25 ℃条件下诱导3～5 d，收集灰霉病病菌的孢子并过滤除去菌丝，调至100倍显微镜下每个视野30～40个孢子，将100 μL孢子悬浮液均匀地涂布在含药的水琼脂培养基平板上，以无药水琼脂培养基平板为对照，每个处理3次重复，25 ℃黑暗培养12 h后，观察孢子萌发情况，与不含药的培养基平板相比，不能或几乎不能在该浓度的含药培养基平板上正常生长的菌株为敏感菌株，能正常生长的菌株为抗性菌株。

统计各个地区各个寄主上灰霉病病菌的抗性菌株的发生频率。抗性频率=抗性菌株数/测定总菌株数×100%。

2 结果与分析

2.1 长三角地区果蔬灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗药性

2013—2014年从长三角的9个地区、6种不同果蔬作物的病叶或病果上采集分离得到210株灰霉病病菌菌株，采用最低浓度抑制法检测这些菌株对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利等3种传统杀菌剂的抗药性。由表2可知，210株灰霉病病菌菌株对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗药性较高，抗性频率分别为68.57%、70.48%、68.10%。比较210株灰霉病病菌菌株的抗药性结果发现，采自不同地区、不同寄主的灰霉病病菌对同种药剂的抗药性不同，但采自同一地区、同种寄主的灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗性频率总体上差异较小。总体来看，在所有采集灰霉病病菌菌株的9个地区，仅扬州地区的灰霉病病菌对3种药剂的抗性频率均较低，采自盐城、淮安、镇江、南通、苏州、上海、嘉善、宁波等地区的灰霉病病菌对上述3种传统药剂均产生了较高的抗药性。由表3可知，对于不同寄主上的灰霉病病菌来说，从草莓、黄瓜和番茄的病叶或病果上分离的灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗药性较高；此外，采自莴苣、瓠瓜上的灰霉病病菌也检测到了部分抗性菌株，但由于在这2种寄主上分离得到的灰霉病病菌数量较少，若要准确评价其抗药性，须进行后续的样品采集和抗药性检测工作。综合上述结果发现，嘧霉胺、多菌灵、腐霉利这3种传统杀菌剂对长三角不同地区、不同寄主上的灰霉病病菌的抑制效果较差。

2.2 长三角地区果蔬灰霉病病菌对咯菌腈和啶酰菌胺的抗药性

为了综合评价长三角地区果蔬灰霉病病菌对传统杀菌剂和新型杀菌剂的抗药性情况，指导生产实践，对采自长三角不同地区、不同寄主上的210株灰霉病病菌菌株对咯菌腈和啶酰菌胺的抗药性进行检测。由表4可知，在210株灰霉病病菌菌株中，未检测到对咯菌腈产生抗药性的菌株，说明咯菌腈对灰霉病病菌具有较好的防治效果。关于灰霉病病菌对啶酰菌胺的抗药性，检测啶酰菌胺对孢子萌发的抑制效果，灰霉病病菌并未能在试验过程中全部产孢，产孢率较低，经过孢子诱导条件的优化，仍有59株灰霉病病菌未能成功产孢，产孢率为71.90%，因此最终检测151株成功产孢的灰霉病病菌对啶酰菌胺的抗药性。

表2 长三角不同地区果蔬灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗性频率

表3 长三角地区不同种果蔬作物上灰霉病病菌对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利的抗性频率

表4 长三角不同地区果蔬灰霉病病菌对咯菌腈和啶酰菌胺的抗性频率

由表4、表5可知，全部检测的151株成功产孢的灰霉病病菌中，在5.0 μg/mL鉴别浓度下，检测到23株对啶酰菌胺产生抗药性的菌株，抗性频率为15.23%。从不同地区菌株的抗性频率来看，不同地区之间菌株抗性差异较大，淮安、嘉善、宁波等地区菌株的抗性频率较高，但由于检测的菌株数量较少，须要进行后续的菌株采集和抗药性检测工作，进一步评价这3个地区菌株的抗药性；苏州地区的菌株抗性频率较高，达到26.32%；南通、上海等地区的菌株抗性频率较低，盐城、镇江、扬州等地区未发现对啶酰菌胺产生抗药性的菌株。对于采自不同寄主菌株的抗药性来说，黄瓜和瓠瓜上的灰霉病病菌抗药性较高，莴苣和西瓜上未发现对啶酰菌胺产生抗药性的菌株，但因菌株数量较少，须要进行后续的菌株采集和抗药性检测工作，进一步评价上述4种寄主上灰霉病病菌的抗药性；在草莓和番茄上发现了抗性菌株，但抗性频率也较低。综上所述，在长三角地区部分地区不同果蔬品种上检测到对啶酰菌胺产生抗性的菌株，但抗性频率较低。

表5 长三角地区不同种果蔬作物上灰霉病菌对咯菌腈和啶酰菌胺的抗性频率

3 讨论与结论

灰霉病病菌给农业生产造成了极其严重的危害[16-17]，长期以来用于防治果蔬灰霉病的传统杀菌剂主要包括嘧霉胺、多菌灵、 腐霉利等[18]。这些传统的化学防治药剂均已发现抗性菌株，这些药剂在农业生产中的防治效果较差，在国内外关于很多地区都相继报道了灰霉病病菌对一些传统的化学防治药剂产生了较高的抗药性[18-20]。

本研究综合评价了长三角不同地区不同寄主上的灰霉病病菌对上述3种传统杀菌剂的抗药性情况，结果表明，从长三角9个地区、6种果蔬作物采集分离得到的210株灰霉病病菌，对3种杀菌剂均表现出很高的抗性水平，抗性频率分别为68.57%、70.48%、68.10%。除扬州地区外，其他8个地区的灰霉病病菌均对上述3种杀菌剂产生了较高抗药性；除采自部分寄主上的灰霉病病菌菌株数较少外，草莓、黄瓜、番茄上的灰霉病病菌对上述3种杀菌剂均产生了较高抗药性。表明3种传统型对长三角地区灰霉病的防治效果较差，说明在农业生产中须要选择新型替代杀菌剂防治果蔬灰霉病。

咯菌腈和啶酰菌胺是防治果蔬灰霉病效果较好的新型杀菌剂[21]，检测采自长三角地区的210株灰霉病病菌对这2种杀菌剂的抗药性，未发现对咯菌腈产生抗药性的菌株，说明咯菌腈对灰霉病病菌具有较好的防治效果，对咯菌腈的使用应做好抗性预防工作。

在成功产孢的159株灰霉病病菌菌株中，检测到对啶酰菌胺产生抗性的菌株有23株，抗性频率为15.23%，抗性频率较低；除了部分检测菌株数较少的地区外，苏州地区灰霉病病菌对啶酰菌胺的抗药性较高，抗性频率达26.32%；说明啶酰菌胺对灰霉病的总体防治效果较好，但部分地区的灰霉病病菌对啶酰菌胺已经产生了较高的抗药性。Veloukas等证实，近年来由于该药剂的大量使用，已经导致啶酰菌胺对灰霉病病菌的防治效果下降[22]。纪军建等的研究也表明，咯菌腈在防治灰霉病时可作为首选药剂，啶酰菌胺在防治灰霉病时可作为候选药剂[23]。

综上所述，咯菌腈在防治灰霉病时效果最好，啶酰菌胺的效果次之，检测到对啶酰菌胺产生抗性的菌株，药剂的田间使用应做好抗性预防工作，同时注意抗药性暴发的风险；对不同地区、不同寄主上的灰霉病病菌的抗药性进行重点监测，指导科学用药。在药剂抗性严重的地区或寄主上，应减少该类药剂的使用次数或使用量，尽量避免单剂使用。建议停止使用嘧霉胺、多菌灵、腐霉利等高抗药剂，推荐使用吡咯类杀菌剂，如咯菌腈等，或烟酰胺类杀菌剂，如啶酰菌胺等，但使用时仍应注意药剂的用量，并注意与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用。