轮状病毒侵入机制研究进展

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(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔161006)

0 引言

轮状病毒(Rotavirus，RV)是人畜共患腹泻病的重要病原之一，能够引起婴幼儿感染甚至死亡，也能够引起仔猪严重脱水性腹泻。该病已经严重影响养猪业的发展。目前尚无治疗该病的特效药，疫苗接种是预防该病的最主要措施，但国内外现有的几种疫苗的免疫效果差强人意。因此，迫切需要发展有效的疫苗和抗病毒策略，这就需要进行大量基础研究，进而对RV与宿主细胞相互作用的分子机制进行更深入理解，鉴于此，就RV的分子侵入机制进行了研究进展综述，旨在为进一步基础研究奠定基础。

1 病原学

RV为呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，为无囊膜的双链RNA病毒，由3层同心蛋白包裹11个分节段双链RNA，编码6种结构蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)。VP4经胰酶裂解为VP8*和VP5*蛋白。其中VP8*蛋白的抗原表位含有唾液酸结合区域，这一区域对于需要唾液酸进行感染的RV来说是至关重要。VP5*含有一个能够增加细胞膜通透性，从而提高病毒侵入细胞能力的区域，这与有囊膜病毒(如流感病毒)类似。VP5*包含了病毒融合功能区域，负责病毒侵入。VP4和VP7蛋白都与最初病毒与宿主细胞间的相互作用有关。它们通过顺序性、特异性的与宿主细胞表面不同受体分子相互作用触发细胞信号级联放大而促进RV侵入宿主细胞，在病毒侵入宿主细胞过程中担当重要角色[1]。

2 侵入机制

RV目前可能有两种侵入途径，一种是直接穿透细胞膜途径，另一种是内吞途径。内吞途径又分为网格蛋白依赖的内吞途径、非网格蛋白或小窝蛋白依赖的内吞途径和巨胞饮。病毒侵入宿主细胞作为病毒感染宿主的第一步，在病毒的整个生活周期中非常重要，同时也是研究者们制定抗病毒研究策略的重要靶标和方向。

2.1 直接穿透细胞膜途径

基于电镜数据和观察到的RV感染会诱导细胞膜的快速渗透，研究者提出直接的细胞膜穿透作为RV侵入宿主细胞的机制。通常RV经肠道上皮细胞中的胰酶裂解被激活，从而提高其感染性。但有研究显示，未经胰酶激活RRV 株轮状病毒同样可以感染 MA104 细胞，所以推测其可能通过其他侵入途径侵入宿主细胞。通过使用阻止内体酸化的抑制剂(如 NH4Cl)或阻止内吞泡的胞内运输的抑制剂均不能抑制RV感染；通过生化试验分析及电镜观察证明，RV的外层蛋白位于质膜表面，而双层衣壳的病毒粒子被内化[2]。以上结果都支持了RV的直接侵入假说。

2.2 内吞途径

RV侵入宿主细胞是一个多步骤的需要多种受体分子协调的过程。人轮状病毒如Wa、DS-1、WI69 株和动物轮状病毒如UK、YM、TFR-41、SA11-4S、nar3株通过网格蛋白介导的内吞作用和内体的酸化侵入宿主细胞，而猴轮状病毒RRV株，通过不依赖于网格蛋白和小窝蛋白的内吞途径侵入宿主细胞。早期对RV感染细胞的电镜研究显示，内吞作用为病毒内化的途径。更近些的研究发现，能破坏网格蛋白和小窝介导的内吞的相关药物及显性负突变体不会影响轮状病毒感染宿主细胞，而细胞所表达的一种动力蛋白的显性负突变体——即一种GTPase(在一些膜分离过程中有一定作用)不会被病毒所影响。这些结果加上所观察到的胆固醇的消耗会抑制RV感染表明，为了进入细胞，RV可能会用一种新确定的被描述为脂筏依赖的内吞作用的细胞内化途径，这种内吞途径为非网格蛋白和小窝依赖的，它依赖于动力蛋白和其对胆固醇损耗的敏感性。最近还报道，洛霉素A，一种液泡质子ATP酶泵的抑制剂，能够阻断RV感染。基于这一发现，猜测可能存在一种内吞机制与RV的侵入有关[3]。

2.2.1 网格蛋白依赖的內吞途径

受体介导的内吞作用是目前公认的生物体摄取生物大分子的途径，而网格蛋白介导的内吞途径是最主要的受体介导途径。对TFR-41，Wa，UK和RRV株RV的研究显示，用高渗溶液处理细胞从而阻碍网格蛋白网的形成，并且使网格蛋白重链无法表达，会减少除RRV株RV的其他三种毒株的感染力，这表明这三种毒株是通过网格蛋白介导的内吞途径侵入细胞的。经蔗糖或NH4Cl(可破坏细胞的网格蛋白)处理的Caco-2和MA104细胞中，UK株RV颗粒数量明显减少，而RRV株RV颗粒数量无明显变化，这表明UK株RV的侵入依赖于网格蛋白和内体的酸化，而RRV株RV的侵入不依赖于网格蛋白和内体的酸化[2-4]。

2.2.2 非网格蛋白或小窝蛋白依赖性內吞途径

目前对RRV株RV侵入细胞机制研究较多，其是一种对经神经氨酸酶(NA)处理的细胞敏感的毒株，通过整合素α2β1、α5β3和热休克蛋白hsc70作为受体，通过非网格蛋白或小窝蛋白介导的依赖于功能性动力蛋白和细胞表面出现的胆固醇途径侵入细胞。脂筏是一种在质膜中形成横向装配的富含鞘糖脂和胆固醇的膜微结构域，它被认为能够作为顶端细胞蛋白质排列和信号转导的特异性平台，而且同样也富含磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白和其他的信号蛋白和受体，是细胞进行多种生命活动的活跃区域，参与跨膜运输分选、跨膜信号转导和细胞骨架重建等过程。一些有囊膜病毒和无囊膜病毒通过脂筏侵入宿主细胞的报道也在不断增多。

研究发现，药物和显性负性变体影响网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞，但不影响RV感染细胞。胆固醇的下降也可以抑制RV的感染，结合这些结果表明，RV的侵入必须应用新定义的内化途径——即脂筏依赖的内吞。它不依赖于网格蛋白或小窝蛋白，但依赖于胆固醇，并且对胆固醇的减少较敏感，细胞膜胆固醇的消耗会大大削弱RV的感染。如前文提到，RV吸附细胞似乎依赖于神经节苷脂。有研究显示，耐NA和NA敏感性RV的感染力都被神经鞘糖脂生物合成抑制剂(PDMP)部分阻断，而不被细胞O-鞘糖脂的抑制所影响。此外，从含β-甲基环化糊精的细胞膜中提出的胆固醇会将RV的感染力减少超过90%，而不会影响它们结合到细胞上。基于这些研究表明，脂筏可能与RV侵入细胞有关。更近些的报道显示，神经节苷脂GM1、整合素亚单位α2和β3及hsc70都与MA104细胞中的脂筏有关，而且发现感染性病毒粒子与细胞感染早期的这些微结构域有关[5]。总之，这些观察结果表明，脂筏可能在RV的细胞侵入中起重要作用，其在此过程中充当组织脚手架，从而促进病毒粒子与细胞受体间的有效相互作用。

3 结语

RV侵入宿主细胞是一个复杂的过程，涉及一些细胞表面受体和一些外层病毒蛋白的区域。至少有一些细胞受体与蛋白质间的相互作用以顺序的方式发生，它们似乎发生在鞘糖脂丰富的脂质微区域。所需要的一些细胞分子可能解释这些病毒的细胞和组织趋向性。尽管已鉴定出许多细胞分子与早期的病毒与细胞表面的相互作用有关，但仍需确定的是哪种受体在病毒侵入、病毒蛋白与这些受体的相互作用引起的构象改变中和病毒内化的机制中起作用。RV侵入宿主细胞机制较为复杂，可能涉及多种不同的侵入方式。不同毒株的RV侵入细胞以不同的途径，同种毒株RV侵入不同细胞的途径也可能不同，同种RV株的野生型与经细胞培养多代的适应型的侵入途径也可能有所不同。确定RV自然感染成熟肠上皮细胞所用的受体和侵入途径的工作尤为重要。

[1] 闻晓波，冉旭华，宋佰芬. 轮状病毒[M]. 北京：中国农业出版社，2013.

[2] Lopez S, Arias CF. Early steps in rotavirus cell entry.Springer-Verlag Berlin Heideberg[J]. CTMI，2006，309：39-66.

[3] Gutiérrez M, Isa P, Sánchez-San Martin C,etal.Different rotavirus strains enter MA104 cells through different endocytic pathways: the role of clathrin-mediated endocytosis[J]. J Virol，2010，84(18)：9161-9169.

[4] Sanchez-San Martin C, Lopez T, Arias CF, et al. Characterization of rotavirus cell entry[J]. Journal of virology，2004，78(5)： 2310-2318.

[5] Ewers H, Helenius A. Lipid-Mediated Endocytosis[J]. Cold Spring HarbPerspectBiol，2011 ，3(8)：a004721.